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Sistema para transformação de leveduras industriais e detecção de atividade recombinogênica.

Camargo, Maria Evangelina De

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas 2000-04-27

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Sistema para transformação de leveduras industriais e detecção de atividade recombinogênica.
  • Autor: Camargo, Maria Evangelina De
  • Orientador: Vicente, Elisabete Jose
  • Assuntos: Saccharomyces Cerevisae; Transformação De Leveduras; Recombinação Gênica; Permease De Arginina (Can1); Glicoamilase; Leveduras Industriais; Industrial Yeast; Glucoamylase; Gene Recombination; Arginine Permease (Can1); Saccharomyces Cerevisiae; Yeast Transformation
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Notas Locais: Microbiologia
  • Descrição: A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas.
  • DOI: 10.11606/T.42.2000.tde-22012014-091236
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas
  • Data de criação/publicação: 2000-04-27
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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