Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata

Enviar para

Título:
Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata
Autor: Fábregas Batlle, Pere Jordi
Assuntos: Genètica del desenvolupament ; Rates (Animals de laboratori) Genètica
Notas: urn:ES-BaUAB035:0593-90760
urn:oai:ddd.uab.cat:38077
urn:oai:www.tdx.cat:10803/4219
urn:isbn:8469980823
https://ddd.uab.cat/record/38077
urn:ES-BaUAB001:8469980823
urn:tdx-0123102-160141
Descrição: Consultable des del TDX Títol obtingut de la portada digitalitzada Introducció El treball "Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata" parteix de la hipòtesi de treball de què la carcinogènesi i el desenvolupament són processos que comparteixen mecanismes de funcionament com són l'elevat índex de proliferació, la capacitat de migració cel·lular o l'angiogènesi sostinguda i que, per tant, deuen compartir els gens que els regulen. Amb aquest plantejament a l'horitzó, aquest treball té com objectiu detectar gens implicats en el desenvolupament per, en un futur proper, estudiar si estan o no implicats en la carcinogènesi. Per detectar gens durant el desenvolupament es va utilitzar una tècnica de fingerprinting, RNA arbitrarily primed PCR ( RAP-PCR). La RAP-PCR és una tècnica destinada a l'estudi d'expressió gènica diferencial que utilitza, com a material, RNA de les diferents mostres que es volen comparar. En primer lloc el RNA s'ha de convertir a cDNA mitjançant la retrotranscripció (RT) amb la utilització d'un primer de disseny arbitrari. El cDNA obtingut s'amplifica per una reacció de PCR que, en la RAP-PCR, presenta tres particularitats: temperatures baixes d'hibridació en els primers cicles, augment de concentració de sals a la mescla i la utilització d'un primer arbitrari, el mateix o no de la RT. El resultat és l'amplificació d'un determinat nombre de seqüències de DNA que, mitjançant una electroforesi, es visualitzen com un patró de bandes en un gel desnaturalitzant d'acrilamida, poden així comparar-se l'expressió de cada transcrit entre les diferents mostres. Material i mètodes El material, per a la realització de la tècnica de RAP-PCR, es va obtenir mitjançant microdissecció de fetus (E17-E20) procedents de 7 rates (Rattus norvergicus) gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley). Els segments microdissecats corresponien a subdivisions amb criteris anatòmics i embriològics, del tub digestiu des de l'estómac fins al recte. Dels diferents segments microdissecats es va realitzar l'extracció de RNA amb el mètode d'extracció amb tiocianat de guanidini i fenol-cloroform (Chomczynski i Sacchi, 1987). A partir del RNA es va realitzar la retrotranscripció, mitjançant l'acció de l'enzim M-MLV i amb la participació d'un primer arbitrari (D4S 2912-GT), obtenint-se, d'aquesta manera, una primera selecció de cDNAs. El cDNA obtingut es va amplificar per PCR, amb les característiques descrites prèviament, i utilitzant el mateix primer que en la retrotranscripció (D4S 2912-GT). Els productes de PCR varen ser sotmesos a electroforesi en gels de seqüenciació obtenint-se com a resultat un patró de bandes característic i reproduïble. Les diferents bandes es varen retallar dels gels, varen ser eluïdes en aigua i conservades a 4ºC. Després de l'estudi dels patrons d'expressió dels diferents seqüències en els gels d'acrilamida es varen seleccionar 10 bandes per a la seva clonació i posterior seqüenciació. Per a dur a terme la clonació, les bandes es varen lligar al plasmidi pCR2.1, per l'acció d'una lligassa durant 16 hores a 14ºC de temperatura. El producte del lligatge es va utilitzar per transformar, per xoc tèrmic, bacteris competents de l'espècie Escherichia coli (soca To F-10) que, després d'un temps curt de creixement, es sembraven a plaques de Petri que contenien LB-Agar. Després de 14-16 hores de creixement es seleccionaven les colònies de bacteris que havien incorporat el plasmidi amb l'insert i mitjançant PCR es confirmava la incorporació de l'insert de la mida (núm. de parells de bases) desitjada. Amb la informació proporcionada per la PCR s'efectuava la selecció de clons per realitzar la seqüenciació automàtica. Les seqüències obtingudes per la tècnica de la seqüenciació automàtica eren analitzades mitjançant el programa BLAST a les bases de dades de la NCBI i de la UCSC, obtenint-se un llistat d'homologies amb gens seqüenciats en diferents espècies i en el genoma humà, respectivament. A fi de confirmar els resultats i obtenir una informació precisa de la localització de l'expressió es va realitzar la tècnica de la hibridació "in situ" de la banda que, segons la seqüenciació, corresponia a un fragment d'hsp86. Per a tal fi es varen construir ribosondes sense i antisense a partir d'un dels clons bacterians que havien incorporat l'insert. Per a la construcció de les ribosondes, la banda va ésser transferida al plasmidi pBluescript SK, que posseeix promotors de T3 i T7 RNA polimerases (per a la síntesi de les sondes sense o antisense, respectivament), a diferència del pCR2.1 que només en posseeix un d'ells. La síntesi de les ribosondes es va realitzar mitjançant l'acció de les RNA polimerases T3 o T7, utilitzant nucleòtids marcats amb digoxigenina pel marcatge de la sonda i com a motlle el plasmidi linealitzat. La tècnica de la hibridació "in situ" es va efectuar sobre talls sagitals, realitzats en criòstat i adherits a portaobjectes, de fetus sencers de rata, fixats per perfusió amb Paraformaldehid al 4% en PB, procedents de 4 rates gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley) de 17 a 20 dies de gestació. Resultats i discussió Els resultats d'aquest treball varen ésser obtinguts a tres nivells: 1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida 2. Anàlisi de les seqüències 3. Hibridació "in situ" 1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida: Els patrons de bandes en els gels d'acrilamida varen mostrar patrons d'expressió de les diferents bandes, que varen ser identificades per un codi de lletres i números. Aquests resultats varen proporcionar la informació per a decidir les bandes a seqüenciar però en cap cas varen ser considerats com a resultats definitius. 2. Anàlisi de les seqüències: Donat que la metodologia de la RAP-PCR amplifica tot tipus de RNAs, en el nostre cas, hem obtingut tres seqüències de RNA ribosòmic (H3, N0 i N1.2), dues procedents del genoma mitocondrial (E3 i G1), tres RNAs missatgers (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein) i, finalment, dues seqüències (J2 i N1.1) han mostrat una seqüència desconeguda de nucleòtids. Respecte a les seqüències que varen mostrar màxima homologia amb RNAs missatgers l'anàlisi bioinformàtica ens va proporcionar la següent informació: La banda G0, que a la RAP-PCR s'expressa més intensament a la part més anterior del duodè, va mostrar homologia d'un 93% amb Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) i d'un 87% amb Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 és homologa a nivell del seu exó 1 amb Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 que s'ha clonat en un estudi en el que es va considerar com un probable gen supressor de tumors, donada la seva expressió diferencial en dues línies cel·lulars, l'una tumoral i l'altre no. (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073). La banda M2, que a la RAP-PCR s'expressa a les diferents localitzacions sense diferencies remarcables, ha mostrat homologia d'un 92% amb Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein i d'un 84% amb Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , per la qual cosa considerem que és homòloga al gen de l'atròfia òptica tipus 1, a nivell del seu domini GTP. La banda F8, que a la RAP-PCR s'expressa a les mostres corresponents a les parts més distals del tub digestiu, va mostrar homologia d'un 98-100% amb Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homòloga a la hsp 90a humana. 3. Hibridació "in situ" : La Hibridació "in situ" amb les sondes construïdes a partir de la banda F8, corresponent a un fragment del gen de la hsp86 de la rata, va mostrar els següents resultats: la sonda sense no va mostrar hibridació a cap dels talls estudiats i la sonda antisense va mostrar un patró d'expressió molt conservat a les diferents edats del període fetal de la rata. Les localitzacions en les que va hibridar la sonda antisense, amb diferents intensitats de marcatge, són, amb una ordenació craniocaudal, les següents: escorça cerebral, capa ependimaria dels plexes coroïdals, epiteli de les cavitats nasal i nasofaringea, glàndules salivals, glàndules glossopalatines, epiteli de revestiment dels bronquis de gran mida, timus, greix bru, ganglis raquidians, cèl·lules hematopoètiques o hepatòcits a nivell hepàtic, epiteli i serosa del intestí prim i gros, escorça renal i suprarenal i cèl·lules germinals del testicle. Dels resultats obtinguts en la HIS amb la sonda F8 destaquem que existeix expressió del gen de la hsp86 en els epitelis nasal i bronquial, revestiment ependimari dels plexes coroïdals i en cèl·lules germinals del testicle, localitzacions en les què les cèl·lules presenten cilis o flagels. Els cilis i flagels estan formats per una estructura interna, l'axonema, constituïda, en vertebrats, per nou doblets de microtúbuls que n'envolten a dos centrals. Cada microtúbul esta format per protofilaments constituïts per heterodímers d'a i b tubulina. Es coneix bé que la hsp90a es la xaperona que col·labora en el plegament de les tubulines, pel que considerem que l'expressió de la sonda F8 en les localitzacions en les que hi ha elements mòbils, es deu a aquest fet. S'ha relacionat hsp90a amb càncer degut a què aquestes proteïnes col·laboren en el plegament de proteïnes necessàries pel creixement i la divisió cel·lular. Per altre banda, Mizuno et al (2001) recentment han descrit la interacció de hsp90a i hsp90b amb Pim-1, un protooncogén relacionat amb proliferació cel·lular en limfomes i leucèmies. Així mateix, s'ha observat sobrexpressió d'hsp90a en diferents tipus de càncer (d'endometri, de pàncrees, de mama, de nasofaringe, de glàndules salivals i en leucèmies), alguns dels quals es desenvolupen en teixits a on s'expressa la sonda F8 durant el període fetal de la rata. Tots aquests fets recolzen la re
Editor: Bellaterra: Universitat Autònoma de Barcelona
Data de criação/publicação: 2002
Idioma: Catalão

Links

View record in Universitat Autònoma de Barcelona$$FView record in $$GUniversitat Autònoma de Barcelona

Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata

Fábregas Batlle, Pere Jordi

Bellaterra: Universitat Autònoma de Barcelona 2002

Buscando em bases de dados remotas. Favor aguardar.