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Clonagem e expressão
de
VP1 recombinante do vírus Cxsackie B5
Humberto Freire Boncristiani Junior Eurico
de
Arruda Neto
2003
Localização:
FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto
(Boncristiani Junior, Humberto )
(Acessar)
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Título:
Clonagem e expressão
de
VP1 recombinante do vírus Cxsackie B5
Autor:
Humberto Freire Boncristiani Junior
Eurico
de
Arruda Neto
Assuntos:
ENTEROVÍRUS
;
GENÉTICA MOLECULAR
Notas:
Dissertação (Mestrado)
Descrição:
Os enterovírus são picornavírus freqüentemente associados com infecções humanas sérias, tais como meningites, meningoencefalites e miocardites. Na proteína
de
capsídeo VP1 se encontram os sítios imunogênicos mais importantes e a resposta immune
de
proteção depende principalmente
de
anticorpos neutralizantes direcionados para os epítopos
de
VP1. Nós descrevemos tentativas
de
clonagem e expressão da proteína VP1 do vírus coxsackie-B5 em três diferentes sistemas. A região do RNA genômico que codifica a proteína VP1
de
vírus coxsackie B5 foi amplificada por transcrição reversa e reação em cadeia da polymerase (RT-PCR), com iniciadores contendo sítios
de
restrição para as enzimas Not I e EcoR I. O produto desta RT-PCR foi clonado no vetor e transfectados em E.coli, e então sub-clonados nos plasmídeos pPIC 9, para expressão em Pichia pastoris e pQE-31 para expressão em E.coli. O sistema
de
expressão em Pichia pastoris foi usado na intenção
de
obtenção
de
grandes quantidades
de
proteínas secretadas modificadas pós-traducionamente. Pichia pastoris foi transformada e inserção genômica foi confirmada por PCR. Após indução de expressão, SDS PAGE mostrou uma banda com peso molecular apropriado, que não reagiu em "western blot" com anticorpos monoclonal e policlonal anti-VP1 de vírus coxsackie B5. Utilizamos então o sistema de . expressão e E.coli com indução de expressão com IPTG. Após rompimento da bactéria transformada, o extrato foi analisado por SOS-PAGE e r novamente
não houve reação em "western blot" com anticorpos anti-VP1
de
vírus coxsackie B5 nativa. Nós então clonamos o gene
de
VP1 no vetor pEG(KG) para inserir o gene em Saccharomyces cerevisiae. Após indução
de
expressão com galactose, uma proteína
de
fusão com GST foi detectada, em pequena quantidade, em "western blot" com anticorpo anti-GST I com peso molecular correspondente à soma
de
VP1 e GST (50-55KD). Em conclusão, VP1
de
coxsackie B5 foi expressa em .. Saccharomyces cerevisae transformada por recombinação homóloga. Esta construção permite subclonagem em outros sistemas
de
expressão, úteis para produção em larga escala, para estudos posteriores, tais como caracterização da função metabólica e imunogenicidade da proteína VP1 recombinante
Data de criação/publicação:
2003
Formato:
86 p.
Idioma:
Português
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