Mutações sítio-dirigidas nas regiões do sítio-ativo e da interface oligomérica do fator inibitório da migração dos macrófagos de Leishmania major (LmMIF2)

• Autor: Cunha, Elise Marques Freire
• Orientador: Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
  
• Assuntos: Fator Inibitório Da Migração De Macrófagos; Leishmania Major; Mutagênese Sítio-Dirigida; Macrophage Migration Inhibitory Factor; Site Direct Mutagenesis
• Notas: Dissertação (Mestrado)
  
• Descrição: O fator inibitório da migração de macrófagos (MIF) é considerado um importante fator no controle de infecções causadas por patógenos. Essa proteína foi encontrada primeiramente em mamíferos, mas verificou-se a presença de ortólogas em patógenos, sendo sugerida uma função moduladora do sistema imunológico do hospedeiro. A caracterização estrutural e funcional da proteína MIF em Leishmania major pode contribuir para o entendimento das funções dessa proteína na relação parasita/hopedeiro. Este trabalho teve como objetivo realizar mutações sítio-dirigidas da sequência codificadora do fator inibitório da migração de macrófagos de Leishmania major (LmMIF2) e investigar o efeito dessas mutações na manutenção da estrutura e na função dessa proteína. A mutagênese sítio-dirigida foi realizada em 3 etapas de reações de PCR, os fragmentos obtidos foram purificados, seqüenciados e clonados em vetor pET21b usando as enzimas de restrição NdeI e HindIII. A LmMIF2 recombinante (rLmMIF2) e os mutantes P2G, K34E, W66L, W108F e Δ104-113, todos eles contendo uma cauda de histidina, foram eficientemente expressos na forma solúvel em E. coli e foram purificados do lisado celular por cromatografia de afinidade. O gel de SDSPAGE mostrou uma banda única em 14.5kDa e análises de filtração em gel mostraram que, em solução, o rLmMIF2 e os mutantes apresentaram-se como dímeros. Experimentos de dicroísmo circular (CD) e de emissão de fluorescência intrínseca de triptofanos (IFTE) foram realizados para acompanhar as mudanças na estrutura secundária e terciária dessas proteínas na variação de pH do ambiente. Análises de CD UV-distante e UV-próximo mostraram que a mutação de apenas um aminoácido pode influenciar na estrutura secundária e terciária da rLmMIF2 e que as mutações não alteraram a formação de estado de glóbulo fundido em baixos pHs. Os experimentos de IFTE mostraram que há um efeito de supressão intrínseca de fluorescência que foi abolido com a substituição do triptofano da posição 108. O mutante W66L mostrou uma intensidade de fluorescência 60% menor enquanto o mutante W108F apresentou uma intensidade 25% maior do que a rLmMIF2. Ensaios de inibição da migração de macrófagos mostraram que o mutante P2G apresentou atividade de inibição da migração similar à rLmMIF2, enquanto os outros mutantes apresentaram uma atividade diminuída em cerca de 50%. Estes resultados contribuem para elucidar o papel de regiões da LmMIF2 envolvidas na manutenção da estrutura e em mudanças conformacionais da proteína, que podem estar envolvidas na atividade de modulação da resposta imune do hospedeiro.
  
• DOI: 10.11606/D.59.2011.tde-06102020-121432
  
• Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
  
• Data de criação/publicação: 2011-08-05
  
• Formato: Adobe PDF
  
• Idioma: Português