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Construção e análise de mutantes fluorescentes da troponina I

Oliveira, Deodoro Camargo Silva Gonçalves De

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química 2001-08-10

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Construção e análise de mutantes fluorescentes da troponina I
  • Autor: Oliveira, Deodoro Camargo Silva Gonçalves De
  • Orientador: Reinach, Fernando de Castro
  • Assuntos: Estrutura E Função De Proteínas; Regulação Da Contração Muscular; Mutação Sítio-Dirigida; Fuorescência; Troponina; Protein Structure And Function; Fluorescence; Regulation Of Muscle Contraction; Site-Directed Mutagenesis; Troponin
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina.
  • DOI: 10.11606/T.46.2001.tde-01102006-180039
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química
  • Data de criação/publicação: 2001-08-10
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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