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Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e expressão da giroxina em célula de mamífero

Yonamine, Camila Miyagui

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares 2007-12-05

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e expressão da giroxina em célula de mamífero
  • Autor: Yonamine, Camila Miyagui
  • Orientador: Camillo, Maria Aparecida Pires
  • Assuntos: Giroxina; Clonagem; Crotalus; Expressão; Serino Proteases; Trypsin; Thrombin; Snakes; Serine Proteinases; Mammary Glands; Animal Cells; Escherica Coli; Enzyme; Cloning; Venoms
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica.
  • DOI: 10.11606/D.85.2007.tde-16052012-081641
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares
  • Data de criação/publicação: 2007-12-05
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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