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Análise da expressão gênica no pistilo de Nicotiana tabacum identificação de genes específicos por hibridização subtrativa e caracterização temporal e celular

Henrique Cestari de Paoli Maria Helena de Souza Goldman

2006

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Paoli, Henrique Cestari de )(Acessar)

  • Título:
    Análise da expressão gênica no pistilo de Nicotiana tabacum identificação de genes específicos por hibridização subtrativa e caracterização temporal e celular
  • Autor: Henrique Cestari de Paoli
  • Maria Helena de Souza Goldman
  • Assuntos: GENÉTICA VEGETAL; REPRODUÇÃO VEGETAL
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: O sucesso da reprodução das plantas depende da função do pistilo em receber e discriminar os grãos de pólen, tanto quanto proporcionar as condições apropriadas para o crescimento do tubo polínico. Identificar e caracterizar genes especificamente expressos no pistilo são a chave para um melhor entendimento desses processos ao nível molecular. Com esse propósito, foi construída uma biblioteca subtrativa suprimida (SSH1) utilizando cDNA de estigma/estilete como "tester" e cDNA de raiz, caule, folha, sépala e pétala como "driver". Para validar a biblioteca, utilizou-se uma sonda para o gene de uma metiltransferase, específico de pistilo, previamente identificado e caracterizado por nosso grupo de trabalho (ANGELO, 2001). Após esta validação, foram seqüenciados 1651 clones, gerando 984 ESTs com valor de Phred/Phrap > 20. Estas, foram agrupadas pelo CAP3, resultando em 147 singlets e 81 contigs. Alguns desses agrupamentos eram redundantes entre si, totalizando 192 transcritos distintos. A análise dessas seqüências, usando os programas BlastX e BlastN, mostrou que 128 seqüências eram similares a outras já caracterizadas e depositadas em bancos de dados internacionais. Por outro lado, 21 seqüências codificavam proteínas hipotéticas e 43 não tinham similaridade significativa, resultando em 33,3% de seqüências novas. Uma análise adicional no banco de dados TOBEST (TOBacco ESTs) , que é constituído de 4.930 transcritos de estigma/estilete de Nicotiana tabacum,
    demonstrou identidade com somente 100 transcritos, enquanto que as 92 seqüências restantes (47,9%) não haviam sido ainda identificadas no estigma/estilete dessa planta e, talvez, correspondam a transcritos de baixa abundância. A análise in silico de sublocalização celular, feita a partir da tradução dos transcritos, revelou que a maioria das proteínas (24,16%) estava sendo direcionada para o meio extracelular/membrana plasmática, além das proteínas que estavam sendo direcionadas para o citoplasma, vacúolo, núcleo, mitocôndria, cloroplasto e retículo endoplasmático. Para confirmar a expressão diferencial dos genes identificados na biblioteca, cinco clones foram selecionados para a análise por RT -PCR em tempo real, validando a expressão preferencial de estigma/estilete de quatro transcritos, e preferencial de órgão reprodutor dos cinco genes. Dentre estes, o transcrito (NtHT) com homologia ao gene da proteína HT de N. Alata, se mostrou específico de pistilo e tem uma expressão mais de 50 vezes maior no estigma/estilete quando comparado ao ovário. Ao mesmo tempo, o estigma/estilete de plantas transgênicas STIG1::Barnase, nas quais a zona secretória do estigma está ausente, demonstrou uma expressão significativamente menor que a das plantas selvagens. Isto sugere a presença deste transcrito, de uma forma preferencial, nas células que compõem este tecido deletado. Adicionalmente, a análise da expressão deste gene, durante os doze
    estágios do desenvolvimento floral, exibiu um padrão transcricional desde o estágio 6 até o estágio 12, com um nível máximo de expressão no estágio 10. Paralelamente, foram realizados experimentos de hibridização in situ e detectou-se a presença deste transcrito nos tecidos especializados do pistilo, atravessados pelo tubo polínico durante seu crescimento em direção ao óvulo. Similarmente, visualizou-se um forte sinal nas células do tegumento externo do óvulo, próximo à micrópila, que interagem com a superfície do tubo polínico, além do funículo e da parede do carpelo, de papel principalmente estrutural. Dessa forma, foi proposta uma direção, em função dos mecanismos que coordenam a interação pólen-pistilo, principalmente no estigma úmido. Além disso, foi feita a caracterização molecular do gene NtHT, homólogo ao gene NaHT, previamente proposto como envolvido na auto-incompatibilidade em N. alata. Entretanto, nossos resultados sugerem uma função mais geral do produto desse gene na reprodução de plantas, assim como para a reprodução de N. tabacum, uma espécie auto-compatível
  • Data de criação/publicação: 2006
  • Formato: 104 p.
  • Idioma: Português
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