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Clonagem e expressão dos domínios 2 e 3 do receptor KDR (VEGFR-2) humano

Castro, Leila Spinola E

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto 2009-09-02

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Clonagem e expressão dos domínios 2 e 3 do receptor KDR (VEGFR-2) humano
  • Autor: Castro, Leila Spinola E
  • Orientador: Ward, Richard John
  • Assuntos: Pla2lys49; Proteína; Receptor Domínio Quinase (Kdr); Pla2lys49; Protein; Receptor Domain Kinase (Kdr)
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, resulta numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido crescimento do tumor [1]. Uma variedade de fatores estimulam a angiogênese, entre eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus receptores (VEGFR). O VEGF é uma proteína homodimérica cujas atividades biológicas são reguladas através da ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase domain receptor KDR). Dos sete domínios extracelulares de Ig-like no KDR, apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta afinidade com o VEGF. Yamazaki e colaboradores, em 2005, relataram que um componente protéico designado KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta afinidade, resultando no bloqueio subnanomolar de VEGF. Yamazaki et.al. demonstrou que KDRbp exibe a sequência de aminoácidos da região N-terminal e de fragmentos enzimaticamente digeridos da sequência peptídica de KDR-bp é idêntica a Lys-49-fosfolipase A2, um homólogo inativo da fosfolipase A2, no qual a Lys-49 substitui Asp-49. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a síntese funcional de uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do Receptor-2 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser expressa em bactéria Escherichia coli (E.coli), permita aplicações otimizadas de seus códons. O cDNA (HUVEC) de KDR que serviu de molde para a amplificação pela reação em cadeia da polimerase para a obtenção do DNA de 675 pares de bases (pb) que codificam 225 aminoácidos correspondentes aos domínios 2 e 3 de KDR. Visando a otimização do uso de códons da construção do DNA que podem prontamente aperfeiçoar os códons para a expressão da proteína em todo o organismo do hospedeiro, no caso, a bactéria Escherichia coli (E.coli), foi desenhada e sintetizada uma sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo 2 e 3 do KDR). O constructo 2 e 3 do KDR obtido por PCR foi expresso em E.coli BL21 usando o vetor de expressão pET28a. A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA correspondente a sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de manipulação e rapidez no resultado. A ORF (open reading frame) que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor pET28a e a expressão foi induzida por IPTG. A análise da expressão foi monitorada e observado o sucesso devido a obtenção de proteína de 25 kDa expressos.
  • DOI: 10.11606/D.59.2009.tde-15102009-080134
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
  • Data de criação/publicação: 2009-09-02
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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