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Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12

Castro, Danielle Karoline Silva Do Vale

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química de São Carlos 2018-07-30

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Reconhecimento molecular de septinas: estudos da interface entre SEPT7 e SEPT12
  • Autor: Castro, Danielle Karoline Silva Do Vale
  • Orientador: Garratt, Richard Charles
  • Assuntos: Biologia Estrutural E Gtpases; Proteínas; Septinas; Gtpases; Proteins; Septins; Structural Biology
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: A família das septinas caracteriza-se pela capacidade de ligar nucleotídeos de guanina e de se associarem formando filamentos. Diversas funções biológicas têm sido reportadas para esses filamentos e sua dissociação pode estar relacionada a patologias. A septina 12 humana expressa especificamente em testículos, foi identificada em filamentos que compõem o annulus do espermatozoide, cuja integridade está relacionada com a morfologia deste. Embora muitos estudos tenham sido reportados, vários aspectos das bases moleculares e fisiológicas de sua função e automontagem permanecem desconhecidos. Neste trabalho, procurou-se obter informações estruturais para o domínio de ligação ao nucleotídeo da SEPT12 (SEPT12G), do mutante SEPT12GT89M e do heterodímero SEPT7-SEPT12. A expressão destas proteínas foi realizada em células de E. coli da linhagem Rosetta(DE3) pelos vetores de expressão pET28a(+) e pETDuet-1. As etapas de purificação foram cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína SEPT12G foi submetida à avaliação do estado oligomérico, fluorescência intrínseca, ensaios de conteúdo de nucleotídeo, atividade GTPásica e transição térmica. O heterodímero SEPT7-SEPT12 foi submetido à avaliação do estado oligomérico e conteúdo de nucleotídeo. Ensaios de cristalização foram realizados para todas as proteínas. A coleta de dados realizada na linha I24 do Diamond Light Source (Didcot, Inglaterra) resultou em conjuntos de dados de alta resolução para a SET12G, SEPT12GT89M e baixa resolução para a SEPT7NGc. Os estudos biofísicos mostraram que a SEPT12G foi obtida em sua forma nativa ou, seja, capaz de ligar e hidrolisar o nucleotídeo GTP e que o heterodímero obtido apresentou ambas as proteínas. As estruturas cristalográficas foram resolvidas e permitiram realizar observações importantes para o grupo I das septinas humanas (SEPT3, SEPT9 e SEPT12). Para a SEPT12 pôde-se observar como a mudança que ocorre no motivo G4 pode alterar a estabilidade da interface G. No contexto do grupo I esta estrutura permitiu concluir que todas as proteínas deste subgrupo podem formar duas interfaces NC, dos tipos aberta e fechada. Além disso, reforçou a observação da orientação diferencial da hélice α5\', cuja função ainda não está esclarecida, mas sem dúvidas é um diferencial que caracteriza este grupo, possivelmente relacionado com a ancoragem da região polibásica na conformação aberta. A estrutura cristalográfica do mutante SEPT12T89M permitiu observar que a mutação levou a uma alteração na primeira esfera de coordenação do íon Mg2+, mudança que interrompe o mecanismo do switch universal e deixa a proteína catalíticamente inativa. Por fim, o estudo cristalográfica do complexo entre a SEPT12 e SEPT7 não foi possível, uma vez que todas as tentativas resultaram em cristais contendo apenas a SEPT7, o que pode ser consequência da precipitação da SEPT12 ou da condição de cristalização utilizada, que desestabiliza o heterodímero.
  • DOI: 10.11606/D.75.2018.tde-04122018-135816
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química de São Carlos
  • Data de criação/publicação: 2018-07-30
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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