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Análise funcional em escala genômica do reparo da lesão C8-metilguanina em Saccharomyces cerevisiae

Bruno Brasil Horta Luis Eduardo Soares Netto

2004

Localização: IB - Instituto de Biociências    (M-1185 )(Acessar)

  • Título:
    Análise funcional em escala genômica do reparo da lesão C8-metilguanina em Saccharomyces cerevisiae
  • Autor: Bruno Brasil Horta
  • Luis Eduardo Soares Netto
  • Assuntos: DNA RECOMBINANTE; RADICAIS LIVRES; ENZIMAS
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: O DNA freqüentemente sofre lesões resultantes da exposição a agentes endógeneos e exógenos. Essas lesões podem alterar as propriedades codificadoras das bases nitrogenadas do DNA, podendo resultar em mutações ou morte celular. Além de lesões oxidativas, as mais freqüentemente produzidas, as adições de grupos alquila a bases do DNA também podem ocorrer em sistemas biológicos. Radicais livres centrados no carbono têm preferência pela posição C8 de resíduos de guanina. C8-Meguanina (C8-MeGua) foi identificada em hidrolisados de DNA de fígado e do cólon de ratos tratados com 1,2-dimetilhidrazina (Netto e col., 1992) e em hidrolisados de fígado e estômago de ratos tratados com terc-butilhidroperóxido (Hix e col., 2000), evidenciando a alquilação in vitro de DNA por radicais metila. Desde então, C8-MeGua foi proposta como um marcador da alquilação de DNA por radical metila, sendo desenvolvidos métodos de identificação e quantificação utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção eletroquímica (Gomes e col., 1995). A verificação da existência de mecanismos de reparo de C8-metilguanina seria uma indicação da importância dessa lesão in vivo e, conseqüentemente, da ação deletéria de radicais livres centrados no carbono em DNA de células. Em Escherichia coli, a enzima Alka (3-metiladenina DNA N-glicosilase II) foi sugerida como tendo uma atividade apenas secundária de remoção de C8-MeGua (Gasparutto e col.,
    2002). Através do ensaio da clivagem de C8-MeGua sítio-especificamente incorporada em oligonucleotídeo ['ANTPOT.32 P']-marcado, semelhante ao utilizado por Gasparutto e col. (2002, confirmamos que Alka possui baixa atividade de clivagem de C8-MeGua, especialmente no caso do pareamento C8-MeGua/citosina. Porém nossos resultados obtidos com o uso de DNA de alto peso molecular, onde C8-MeGua foi gerada pela metilação de guanina no pareamento guanina/citosina, mostram que Alka remove C8-MeGua numa eficiência de 5 a 10 vezes maior do que a remoção desse aduto de oligonucleotídeos sintéticos, sugerindo que C8-MeGua é um substrato natural da Alka. Para buscar uma via de reparo de C8-MeGua em Saccharomyces cerevisiae, utilizamos a técnica de genômica funcional que emprega um conjunto de 6144 linhagens individuais de leveduras (coleção ExClones TM), cada uma contendo uma diferente ORF de levedura fundida com glutationa S-transferase, e ensaios da clivagem de C8-MeGua em DNA de alto peso molecular, aliada à técnica de HPLC com separação por cromatografia de troca catiônica e detecção por espectrofotometria no UV e fluorescência, e em oligonucleotídeo contendo C8-MeGua sítio-especificamente incorporada em sua seqüência. Não detectamos atividade C8-MeGua DNA N-glicosilásica na coleção. Entretanto, nossos resultados não são suficientes para descartar a possível existência de uma via de reparo de C8-MeGua em S.
    cerevisiae. A proteína Mag1p (e-metiladenina DNA N-glicosilase) seria uma forte candidata, porém, não conseguimos observar qualquer atividade N-glicosilásica em Mag1p recombinante.
  • Data de criação/publicação: 2004
  • Formato: 108 p il.
  • Idioma: Português
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