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Caracterização funcional e estrutura de uma nova serinoprotease do veneno de Bothrops jararacussu

Carolina Dalaqua Sant'ana Suely Vilela Sampaio

2005

Localização: FCFRP - Fac. Ciên. Farm. Ribeirão Preto    (Sant'Ana, Carolina Dalaqua )(Acessar)

  • Título:
    Caracterização funcional e estrutura de uma nova serinoprotease do veneno de Bothrops jararacussu
  • Autor: Carolina Dalaqua Sant'ana
  • Suely Vilela Sampaio
  • Assuntos: SERPENTES; VENENOS DE ORIGEM ANIMAL; TOXICOLOGIA
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: Este trabalho teve como objetivo isolar uma proteína com atividade coagulante do veneno de Bothrops jararacussu caracterizando-a bioquímica, enzimática, imunoquímica e estruturalmente. O isolamento da serinoprotease, denominada BjussuSP-I, envolveu duas etapas cromatográficas, a saber uma exclusão molecular em resina G-75 e uma afinidade em Benzamidina Sepharose 6B, e uma etapa de ultrafiltração em sistema AMICON, conferindo um alto grau de pureza à BjussuSP-I, confirmado por SDS-PAGE, PAGE para proteínas ácidas e HPLC de fase reversa em coluna C18. Apresentou uma Mr ~55.000, 27% de carboidratos neutros totais e um pl ~ 3,8, confirmando ser uma glicoproteína de caráter ácido. Apresentou atividade coagulante sobre o plasma, formando um coágulo semi- rígido diferente da trombina que resulta na formação de um coágulo consistente. Sugerimos que esta trombina-símile não apresenta atividade sobre o fator XIII, responsável por estabilizar a rede de fibrina. A enzima apresentou-se estável para esta atividade quando avaliada em diferentes temperaturas (-70 a '100 GRAUS C') e pHs (2,5 a 10,0). Na presença de diferentes íons ('CO POT.2+', 'Mg POT.2+', 'Fe POT.2+', 'Ca POT.2+', 'Mn POT.2+' e 'Zn POT.2+') e inibidores (PMSF, leupeptina, EGTA, EDTA, aprotinina, B-mercaptoetanol, 1,10- phenantrolina e heparina) sua atividade coagulante foi mantida, com exceção para os íons 'Fe POT.2+', 'Ca POT.2+', 'Mn POT.2+' e 'Zn POT.2+' e os inibidores 1,1 0-Phenantrolina, heparina,
    PMSF e leupeptina, provocando uma diminuição na sua atividade coagulante sobre o plasma. Foi observada a diminuição significativa das suas atividades enzimáticas quando incubada com inibidores específicos, como o PMSF e a leupeptina, confirmando sua classificação no grupo das serinoproteases. A atividade proteolítica da trombina-símile foi confirmada sobre os substratos artificiais como (i) BAPNA, S-2238 e S-2288 não apresentando atividade ... sobre a caseína, e os naturais como (i) a fibrina e o fibrinogênio, degradando apenas a cadeia A'alfa'. A atividade esterásica da BjussuSP-I sobre o substrato artificial TAME foi confirmada. Apresentou atividade pró-coagulante e calicreína-simile, mas não apresentou atividade sobre P/laquetas. A BjussuSP-I foi capaz de induzir a produção de anticorpos policlonais (anti- BjussuSP-I), o qual apresentou imunorreatividade com outras espécies de venenos dos gêneros Bothrops, Crotalus, Calloselasma e com uma enzima LAAO isolada do veneno de B. moojeni. Os inibidores naturais, anti-BjussuSP-I e o extrato aquoso de partes aéreas de Bauhinia forficata (AEBf) foram capazes de inibir a atividade coagulante da enzima, sendo que apenas o AEBf foi capaz de inibir a atividade fibrinogenolítica da BjussuSP-I. Esta enzima apresentou atividade edematogênica moderada, quando comparada com a atividade causada pelo veneno bruto de B. jararacussu e não induziu efeito hemorrágico nem miotóxico in vivo, apresentando,
    portanto, características peculiares que a tornam uma proteína de grande interesse na área médico-científica, em casos de pacientes com distúrbios hemostáticos. Através da clonagem e seqüênciamento do cDNA da BjussuSP-1 foi possível realizar um alinhamento múltiplo da estrutura primária desta enzima, confirmando a alta identidade com outras enzimas trombina-símiles. Portanto, a BjussuSP-I confirma ser uma nova trombina-símile isolada do veneno bruto de Bothrops jararacussu.
  • Data de criação/publicação: 2005
  • Formato: 106 p. anexos.
  • Idioma: Português
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