skip to main content
Idioma:
Primo Search
Clear Search Box
Search in: Busca Geral
Busca Avançada
Busca por Índices

Avaliação do potencial de crescimento e produção de proteínas recombinantes de células humanas adaptadas para crescimento em suspensão e meios de cultura livres de soro fetal bovino

Biaggio, Rafael Tagé

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto 2018-10-29

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Avaliação do potencial de crescimento e produção de proteínas recombinantes de células humanas adaptadas para crescimento em suspensão e meios de cultura livres de soro fetal bovino
  • Autor: Biaggio, Rafael Tagé
  • Orientador: Antonietto, Kamilla Swiech
  • Assuntos: Adaptação Celular; Meios De Cultura Livres De Soro Fetal Bovino; Proteína Recombinante; Hemofilia; Fator Vii Da Coagulação; Cultura Em Suspensão; Células Humanas; Serum-Cree Medium; Recombinant Protein; Suspension Culture; Human Coagulation Factor Vii; Human Cell Lines; Hemophilia; Suspension Serum-Free Adaptation
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras.
  • DOI: 10.11606/T.60.2019.tde-24052019-155210
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
  • Data de criação/publicação: 2018-10-29
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
Links
Voltar para lista de resultados
Ir para página anteriorAnterior Resultado  3 AvançarIr para próxima página

  • Realização: ABCD-USP USP   Logos de Redes Sociais: Freepik

Buscando em bases de dados remotas. Favor aguardar.