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Construção de bibliotecas de cDNA com com pcr de baixa estringência e primers híbridos e clonagem e uma apirase de Schistosoma mansoni

Fietto, Juliana Lopes Rangel

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química 2001-03-14

Acceso en línea. La biblioteca tiene también copias físicas.

  • Título:
    Construção de bibliotecas de cDNA com com pcr de baixa estringência e primers híbridos e clonagem e uma apirase de Schistosoma mansoni
  • Autor: Fietto, Juliana Lopes Rangel
  • Orientador: Verjovski-Almeida, Sérgio
  • Materias: Schistosoma Mansoni; Bioquímica; Biologia Molecular; Bibliotecas De Cdna; Apirase; Biochemistry; Cdna Libraries; Molecular Biology; Schistosoma Mansoni
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descripción: Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends).
  • DOI: 10.11606/T.46.2019.tde-23012019-100314
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Química
  • Fecha de creación: 2001-03-14
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Portugués
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