Geração de linhagens Gal4 de Drosophila melanogaster uma ferramenta para o genoma funcional

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Título:
Geração de linhagens Gal4 de Drosophila melanogaster uma ferramenta para o genoma funcional
Autor: Fernanda Carvalho Humann
Maria Luisa Paçó-Larson
Assuntos: DROSOPHILA; GENÉTICA MOLECULAR
Notas: Dissertação (Mestrado)
Descrição: Com o objetivo de obter linhagens de Drosophila para serem utilizadas como driver no sistema bipartido GaI4/UAS, geramos linhagens transgênicas utilizando o vetor pPTGal contendo elementos cis-reguladores identificados no gene BhC4-1 de B.hygida. Um dos elementos está contido em um fragmento de 67pb (-253/-187) e é capaz de ativar a expressão do gene repórter IacZ especificamente na glândula anelar (GA) de Drosophila, desde o primeiro estágio larval. O segundo está em um fragmento de 129pb (-186/-58) e induz a expressão na glândula salivar (GS) especificamente na transição de larva para pré-pupa. Usando a construção pPT67Gal4, obtivemos quatro linhagens transgênicas, quando os animais foram mantidos em 18ºC. A injeção da construção pPT129Gai4 resultou em nove linhagens independentes. Como controle, também geramos sete linhagens diferentes transformadas somente com o vetor. O padrão de expressão de Gal4 nas linhagens obtidas foi avaliado através da expressão de GFP na prole de cruzamentos com linhagens UAS-GFP. Os resultados mostraram que o vetor pPTGal vazio é capaz de dirigir a expressão de GFP especificamente na glândula salivar em todos os estágios larvais e em pré-pupa. Esse mesmo padrão de expressão de GFP foi observado em animais provenientes de cruzamentos utilizando as linhagens transformadas com a construção pPT129Gal4, sugerindo o fragmento de 129pb não foi capaz de promover a regulação temporal da expressão do transgene na glândula salivar no
contexto do vetor pPTGal. Entretanto, as linhagens carregando o ativador de 67pb apresentaram expressão de GFP na glândula anelar em larva e pré-pupa, e no corpus cardiacum e corpus aIlatum do adulto. A expressão de GFP também foi observada nos oenócitos larvais e imaginais na linhagem GA74, e no esôfago de larvas da linhagem GA120, além da expressão ectópica na glândula salivar, inerente ao vetor. A observação de que as moscas pPT67Gal4 somente podem se desenvolver quando os animais transformantes são mantidos a 18°C, ao invés de 25°C, como é feito rotineiramente, sugere que os níveis de Gal4 produzidos pela construção pPT67Gal4 afetam o desenvolvimento. Essa hipótese foi avaliada pela analise da viabilidade das linhagens GA mantidas em diferentes temperaturas durante o desenvolvimento. Duas séries de experimentos foram realizadas. Na primeira, comparou-se a porcentagem de moscas transgênicas que emergiram dos animais mantidos a 18°C, com a porcentagem das moscas que emergiram quando a cultura foi transferida para 25°C, nos diferentes estágios do desenvolvimento (embrião, L1, L2, L3 e pupa). Na segunda, verificamos a porcentagem de moscas transgênicas que emergiram das culturas transferidas de 25°C para 18°C. Os resultados mostraram que nas culturas transferidas de 18°C para 25°C, as moscas transgênicas emergiram somente quando esse processo foi realizado no estágio L3 e pupal. Quando a cultura foi transferida de 25ºC para
18ºC, as moscas transformantes emergiram quando a transferência aconteceu nos estágios embrionário, L1 e L2, mas não depois disso. Esses resultados reforçam a idéia de que a atividade de Gal4 dirigida pela construção pPT67Gal4 afeta a viabilidade, possivelmente interferindo com as funções da glândula anelar. De fato, verificamos que a quantidade de 20-hidroxiecdisona (20E) em larvas no início do terceiro estádio se mostrou alterada de acordo com a temperatura e dose do transgene. A linhagem GA74 também foi usada como ferramenta num estudo preliminar para investigar se a superexpressão de APC2 interferiria com o endociclo na glândula anelar, já que a função deste gene é necessária para manutenção deste tipo de ciclo celular. Observamos que os núcleos da glândula anelar das moscas GFP positivas provenientes de cruzamentos entre moscas pPT67Gal4 e moscas carregando UAS-GFP e UAS-APC2 têm morfologia bastante semelhante à dos núcleos das moscas GFP positivas provenientes de cruzamentos da linhagem pPT67Gal4 com animais carregando somente UAS-GFP. Nossas observações sugerem que a superexpressão de APC2 não interfere com o controle do endociclo na glândula anelar, diferente do observado com a falta desta proteína. Por outro lado, foi interessante a observação de que os oenócitos GFP positivos dos adultos, mas não os larvais, estão ausentes nas moscas carregando o transgene UAS-APC2. Essa observação sugere que a superexpressão de APC2 nos oenócitos
imaginais interfere com a formação desse tecido nos adultos, possivelmente por bloquear proliferação destas células
Data de criação/publicação: 2006
Formato: 65 p.
Idioma: Português

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Geração de linhagens Gal4 de Drosophila melanogaster uma ferramenta para o genoma funcional

Fernanda Carvalho Humann Maria Luisa Paçó-Larson

2006

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