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Caracterização bioquímica das enzimas do complexo xilanolítico de Scutalidium tbermopbilum

Fabiana Fonseca Zanoelo João Atílio Jorge

2001

Localização: FFCLRP - Fac. Fil. Ciên. Let. de R. Preto    (Zanoelo, Fabiana Fonseca )(Acessar)

  • Título:
    Caracterização bioquímica das enzimas do complexo xilanolítico de Scutalidium tbermopbilum
  • Autor: Fabiana Fonseca Zanoelo
  • João Atílio Jorge
  • Assuntos: ENZIMAS; BIOQUÍMICA
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: A xilana é o maior polisacarídeo hemicelulósico presente na parede celular das plantas e depois da celulose é mais abundante fonte de carbono presente na madeira e nos resíduos agrícolas. Na natureza a hidrólise completa da xilana ocorre pela ação sinérgistica de várias enzimas, dentre elas xilanases e 'beta'-xilosidases. Tais enzimas podem ser utilizadas em vános processos industriais como indústria alimentícia, têxtil e de papel e celulose. O fungo termofílico Scytalidium thermophilum estudado, produz altos níveis de atividade enzimática xilanásica e 'beta'-xilosidásica, quando cultivado em resíduos hemicelulósicos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as fontes de carbono que afetam a produção das enzimas do complexo xilanolítico do Scytalidium thermophilum bem como purificar e caracterizar bioquimicamente as enzimas. O meio 'M IND.8' favoreceu a produção e secreção de xilanase e 'beta'-xilosidase. Dentre os açúcares testados como fonte de carbono, a xilana e o avicel foram os melhores indutores das enzimas xilanases e 'beta'-xilosidase intra e extracelular. Foi observado que resíduos naturais como bagaço de cana, farelo de trigo e sabugo de milho também foram ótimos indutores das enzimas. A xilanase extracelular foi purificada utilizando-se colunas de troca iônica CMTrysacril e CM-celulose, e uma purificação de 4,5 vezes a atividade específica de 40 (U/mg proteína) foi alcançada. A análise eletroforética revelou uma única banda em SDS-PAGE e
    PAGE para proteínas básicas. O peso molecular foi estimado em 16 kDa, em coluna de filtração e 29 kDa em SDS-PAGE. A enzima é uma glicoproteína com cerca de 90% de açúcar, o pH e temperatura ótimos foram de 5.0 e 60°C, respectivamente. A atividade enzimática não foi influenciada pela maioria dos íons testados e foi drasticamente inibida por 'Ag POT.+2' e 'Hg POT.+2'. A xilanase purificada não tem atividade amilásica, celulásica, 'beta'-glucosidásica e ) e 'beta'-xilosidásica. Os estudos cinéticos revelaram um 'K IND.m' e 'V IND.máx'. de 4,5 mg/ml e 128 'mü'moles/min.mg proteína, respectivarnente. O produto de hidrólise da xilana pela ação da xilanase purificada foi analisada em cromatografia delgada de sílica, e mostrou que não há produção de xilose e que xilobiose foi produzida após longos períodos de incubação. Desse modo, podemos classificar a enzima como uma endo-xilanase. A 'beta'-xilosidase intracelular foi parcialinente purificada utilizando-se de um tratamento térmico, uma precipitação de 30% de sulfato de amônio, seguindo-se de uma coluna de troca iônica DEAE-celulose e uma Sephadex G-50. A enzima foi purificada 10 vezes com uma atividade específica de 360U/mg proteína após a última coluna cromatográfica. A análise da amostra em PAGE para proteínas ácidas revelou a presença de duas bandas muito próximas. A caracterização partial da enzima revelou um pH a temperatura ótimos de 5.0 a 60°C, respectivamente. A atividade enzimática foi inibida em 43% na
    presença de 'NH IND.4'Cl e ativada em 32% por 'Ca POT.+2' 1mM. A atividade 'beta'-xilosidásica tende a aumentar até 10 mM de 'Ca POT.+2'. A 'beta'-xilosidase não apresentou atividade celulásica, xilanásica ou galactosidásica, porém apresentou pequena atividade contra o PNP-glucopiranosídeo. Estudos cinéticos revelaram um 'K IND.m' de 1,35 e 0,212 mM para os substratos PNP-xil e PNP-glu, respectivamente. A enzima apresenta o mesmo sítio catalítico para os substratos PNP-xil a PNP-glu. A análise dos produtos de hidrólise mostrou que a enzima, além de hidrolisar o substrato sintético PNP-xil, hidrolisa também a xilobiose, a qual é o seu substrato natural
  • Data de criação/publicação: 2001
  • Formato: 98 p anexos.
  • Idioma: Português
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