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Regulação da expressão gênica em Aspergillus nidulans monitoramento do ph extracelular

Andressa Ranzani Nora Mello Antônio Rossi

2002

Localização: FFCLRP - Fac. Fil. Ciên. Let. de R. Preto    (Mello, Andressa Ranzani Nora )(Acessar)

  • Título:
    Regulação da expressão gênica em Aspergillus nidulans monitoramento do ph extracelular
  • Autor: Andressa Ranzani Nora Mello
  • Antônio Rossi
  • Assuntos: BIOQUÍMICA
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: O fungo filamentoso Aspergillus nidulans é um organismo nutricionalmente versátil e pode crescer em várias condições, incluindo variações extremas de pH (2,5-10,5). Essa versatilidade implica na regulação do pH homeostático, onde essas variações não são amplas, e no monitoramento do pH extracelular, para que sejam sintetizadas permeases e secretadas enzimas que efetivamente funcionem no meio externo, como por exemplo, a secreção de fosfatase ácida em meio ácido e fosfatase alcalina em meio alcalino. Nós mostramos que a fosfatase alcalina Pi-repressível secretada pela linhagem pabaA1 é ativada por íons manganês, e é protegida contra a termoinativação por um poliribonucleotídeo isolado do micélio de N. crassa. Além disso, o antibiótico tunicamicina (inibidor de algumas etapas da glicosilação) diminui os níveis de atividade da fosfatase ácida Pi-repressível secretada pela linhagem pabaA1 indicando que a glicosilação desta enzima é importante para a sua atividade e estabilidade, uma vez que ao aumentar a concentração de tunicamicina no meio de cultura, a atividade enzimática secretada diminuiu. Também mostramos através de ELISA que as formas intracelular e extracelular da fosfatase ácida Pi-repressível são sintetizadas tanto pela linhagem controle pabaA1 como pelas linhagens palcA1 e palcC4, porém variando o nível de enzima sintetizada em função do pH de cultivo. As linhagens pabaA1 palcA1 e paIcC4 de A. nidulans foram analisadas quanto á expressão de genes utilizando a
    técnica DDRT-PCR A linhagem mutante palcA1 apresentou um perfil de expressão gênica diferente das demais linhagens. Um dos fragmentos amplificados foi clonado e mostrou identidade com uma catalase, enzima envolvida em mecanismos de proteção do DNA e com a degradação de ácidos graxos, entre outros, sugerindo que o gene palcA também pode estar envolvido na regulação dos mecanismos de reparo celular. Um outro aspecto focado neste trabalho foi a ) clonagem do gene para uma fosfatase alcalina de A. nidulans. DNA da linhagem pabaA1 foi amplificado por PCR com oligonucleotídeos degenerados e construídos em função do alinhamento das seqüências das fosfatases alcalinas Pi-repressiveis dos fungos N. crassa, S. cerevisiae e S pombe. Um dos fragmentos de DNA amplificados apresentou identidade com o cosmídeo SW06H01 (cromossomo VIR AF 188714.1) fungo A. nidulans, embora a ORF correspondente à proteína tenha apresentado baixa identidade com a fosfatase alcalina Pi-repressível de N. crassa. Além disso, oligonucleotídeos específicos foram construídos com base na seqüência nucleotídica da fosfatase alcalina identificada neste cromossomo, para que fragmentos do DNA genômico das linhagens biA1 e biA1 palD8 de A. nidulans fossem amplificados por PCR e comparadas. Isto porque o gene palD é, neste fungo, um gene estrutural para uma fosfatase alcalina Pi-repressível, identificado no cromossomo VII através de análise genética clássica. Se for o mesmo gene, poderíamos identificar
    a mutação. Se não for o mesmo gene, os mesmos fragmentos deveriam ser obtidos para as linhagens mutante e selvagem. A linhagem paID8 biA1 amplificou um fragmento de 400 pb em vez de um fragmento de 1323 pb, que deveria ter sido identificado para a linhagem selvagem em função dos oligonucleotídeos utilizados. Este resultado sugere que a mutação paID8 pode ter levado a uma translocação, com deleção, durante a recombinação genética. Isto se admitirmos que o mapeamento deste gene no cromossomo VII tenha sido feito corretamente
  • Data de criação/publicação: 2002
  • Formato: 78 p.
  • Idioma: Português
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