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Thi1, uma proteína envolvida na síntese de tiamina em Arabidopsis thaliana: análises estruturais do mutante Thi1 (A140V)

Garcia, Assuero Faria

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos 2011-08-12

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Thi1, uma proteína envolvida na síntese de tiamina em Arabidopsis thaliana: análises estruturais do mutante Thi1 (A140V)
  • Autor: Garcia, Assuero Faria
  • Orientador: Araujo, Ana Paula Ulian de
  • Assuntos: Tiazol Sintase (Thi1); Tiamina; Fluorescência; Dicroísmo Circular; Arabidopsis Thaliana; Fluorescence; Circular Dichroism; Thiamine Pyrophosphate; Thiazole Synthase (Thi1)
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade.
  • DOI: 10.11606/T.76.2011.tde-04102011-161654
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos
  • Data de criação/publicação: 2011-08-12
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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