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Estudo e caracterização bioquímica das fosfatases ácidas e alcalinas produzidas pelo fungo filamentoso termotolerante Aspergillus caespitosus

Luis Henrique Souza Guimarães Maria de Lourdes Teixeira Moraes Polizeli

2004

Localização: FFCLRP - Fac. Fil. Ciên. Let. de R. Preto    (Guimares, Luis Henrique S. )(Acessar)

  • Título:
    Estudo e caracterização bioquímica das fosfatases ácidas e alcalinas produzidas pelo fungo filamentoso termotolerante Aspergillus caespitosus
  • Autor: Luis Henrique Souza Guimarães
  • Maria de Lourdes Teixeira Moraes Polizeli
  • Assuntos: BIOQUÍMICA MICROBIANA; MICROBIOLOGIA
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Fosfatases são enzimas amplamente distribuídas em organismos procariotos e eucariotos. Estas enzimas são responsáveis por hidrolisar ésteres e anidridos do ácido fosfórico, e estão envolvidas em vários processos biológicos, tais como assimilação de fósforo, metabolismo intermediário e sinalização celular. Estas enzimas são tradicionalmente divididas em dois grupos de acordo com o pH ótimo de atividade: fosfatase alcalina, com pH ótimo igual ou superior a 8,0 e fosfatases ácidas, com pH ótimo de atuação igual ou inferior a 6,0. Contudo, uma divisão mais atual tem sido proposta, na qual as fosfatases podem ser divididas em cinco grandes famílias: i) fosfatases alcalinas; ii) fosfatases ácidas de alta massa molecular; iii) fosfatases ácidas de baixa massa molecular; iv) fosfatases ácidas púrpuras e v) proteínas fosfatases. De modo geral estas enzimas não apresentam grande especificidade pelo substrato. Fosfatases obtidas de fontes microbianas são particularmente atrativas devido ao seu potencial biotecnológico. Neste trabalho, descrevemos a produção, purificação e propriedades bioquímicas das fosfatases produzidas pela linhagem termotolerante do fungo filamentoso Aspergillus caespitosus, isolado a partir do solo do Estado de São Paulo. Altos níveis de atividade fosfatásica foram obtidos quando o fungo foi crescido em meio SR suplementado com xilana como fonte de carbono para as fosfatases alcalinas e com glicose para as fosfatases ácidas, por um período de 72 horas, sob
    agitação orbital, a 40°C. Quando utilizada xilana como fonte de carbono, a fosfatase alcalina foi observada somente junto aos septos, ao passo que quando empregada a glicose como fonte de carbono a fosfatase alcalina encontra-se associada a membrana/parede celular. Fosfatases alcalinas e ácidas, intracelulares e extracelulares, foram purificadas até a homogeneidade eletroforética através de dois passos cromatográficos: DEAE-Celulose e ... Concanavalina A-Sepharose. A forma alcalina intracelular foi purificada 12,73 vezes com recuperação de 12,35%, ao passo que a forma extracelular foi purificada 17,68 vezes com um fator de recuperação de 26,41%. Já as fosfatases ácidas intracelular e extracelular foram purificadas 12,61 e 62,45 vezes, com recuperação de 11,69% e 14,69%, respectivamente. As fosfatases alcalinas, intracelular e extracelular, apresentaram temperatura ótima de 80°C e 75°C, e tempo de meia vida ('t IND. 50') de 21 minutos e 6 minutos, a 70°C, respectivamente. Ambas as enzimas foram ativadas por 'Mg POT. ++'. Possuem massa molecular de 213,8 ± 14,42 kDa e 134,8 kDa (Sepharose CL-6B), e 71,1 ± 19,7 kDa e 57 kDa (SDS-PAGE), respectivamente. Já as fosfatases ácidas, intracelular e extracelular, apresentaram temperatura ótima de atividade igual a 80°C, com 't IND. 50' de 20 minutos e 7 minutos, a 70°C, respectivamente. As massas moleculares foram iguais a 190 ± 15 kDa e 186,2 kDa (Sepharose CL-6B), e de 74 ± 5
    kDa e 84 kDa (SDS-PAGE). Tais resultados sugerem que tanto as fosfatases alcalinas quanto as fosfatases ácidas, provavelmente, possuem estrutura dimérica. Os parâmetros cinéticos estimados utilizando-se o substrato sintético p-NPP foram: 'V IND. max' de 0,227 U/mg prot. e 'K IND. m' de 0,027 mM para fosfatase alcalina intracelular e 'V IND. max' de 17,08 U/mg prot. e 'K IND. m' de 0,074 mM para a forma extracelular na ausência de 'Mg POT. ++'. Na presença de 'Mg POT.++' os valores foram: 'K IND. m' de 0,041 mM e 0,09 mM, com 'V IND. max' de 0,441 U/mg prot. e 25,07 U/mg prot., respectivamente. As fosfatases ácidas, intracelular e extracelular, apresentaram 'V IND. max' de 0,082 U/mg prot. e de 4,43 U/mg prot., com 'K IND. m' de 0,029 mM e de 0,08 mM, respectivamente. As enzimas produzidas por A. caespitosus são ferramentas promissoras para utilização biotecnológica, considerando sua temperatura ótima de atividade ... e termoestabilidade. Contudo, as fosfatases ácidas apresentaram atividade fitásica. Já a fosfatase alcalina foi capaz de remover grupos 5-fosfato de plasmídios linearizados, sem no entanto hidrolisar o DNA
  • Data de criação/publicação: 2004
  • Formato: 110 p..
  • Idioma: Português
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