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Mecanismos de dissociação das sub unidades a e ß da Na, K-ATPase por agentes químicos e físicos comparação entre a enzima solubilizada e reconstituída em lipossomos

Carolina Fortes Rigos Richard John Ward

2007

Localização: FFCLRP - Fac. Fil. Ciên. Let. de R. Preto    (Rigos, Carolina Fortes )(Acessar)

  • Título:
    Mecanismos de dissociação das sub unidades a e ß da Na, K-ATPase por agentes químicos e físicos comparação entre a enzima solubilizada e reconstituída em lipossomos
  • Autor: Carolina Fortes Rigos
  • Richard John Ward
  • Assuntos: PROTEÍNAS (ESTRUTURA QUÍMICA)
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas a e ß. Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero a aß ou ainda na forma de oligômeros (aß)2 ou (aß)4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica (a aß)2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na, K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,O°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições
    foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40°C (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-¹ para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em a-hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico (aß)2 e forma protômeros aß. A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60°C) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades a, através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína: detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma (aß)2 ou ainda (aß)4 (dependendo da concentração de
    proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado , conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural
  • Data de criação/publicação: 2007
  • Formato: 132 p. anexos.
  • Idioma: Português
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