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Otimização da associação da criopreservação do tecido ovariano bovino com cultivo folicular in vitro em sistema tridimensional para a obtenção de oócitos maduros com finalidade de preservação da fertilidade

Daiane Bulgarelli Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva

2016

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Bulgarelli, Daiane Lopes )(Acessar)

  • Título:
    Otimização da associação da criopreservação do tecido ovariano bovino com cultivo folicular in vitro em sistema tridimensional para a obtenção de oócitos maduros com finalidade de preservação da fertilidade
  • Autor: Daiane Bulgarelli
  • Ana Carolina Japur de Sá Rosa e Silva
  • Assuntos: CRIOPRESERVAÇÃO; OVÁRIO; FOLÍCULO OVARIANO
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: Introdução: a possibilidade da criopreservação do tecido ovariano para posterior cultivo in vitro dos folículos imaturos inclusos e obtenção de oócitos fertilizáveis tem sido sugerida como estratégia para preservação de fertilidade em pacientes oncológicas. Objetivo: avaliar diferentes estratégias de criopreservação de folículo secundário associado com maturação folicular in vitro em sistema tridimensional, capaz de garantir o crescimento até estágio de folículo antral, para obtenção de oócitos fertilizáveis. Metodologia: ovários bovino foram selecionados, cortados em fragmentos de 3x3x0.5mm3 e criopreservados pelo método de vitrificação (Ting et al 2013, modificado). Após a desvitrificação, os folículos secundários foram isolados, encapsulados em alginato (0.25%) e cultivados em ALFA-MEM e/ou TCM, ambos com 5ng/ml FSH por 15 dias em 5% CO2 (estratégia 1) ou tecido ovariano foi submetido ao cultivo por 6 dias (estratégia 2) em meio de cultura com ALFA-MEM suplementado, em placa de 48 poços e incubados em atmosfera úmida de 5% de CO2 e 38,5°C. Folículos secundários, também foram isolados mecanicamente do tecido ovariano fresco e vitrificados em solução de vitrificação contendo 25% de glicerol, 25% etilenoglicol e 12,5% de polímeros (PXZ) (estratégia 3), encapsulados em alginato (0.25%) e cultivados em dois diferentes meios base ALFA-MEM e TCM com 0.5 ng/ml FSH por 15 dias em 5% CO2. Foram avaliados o desenvolvimento dos folículos isolados ao longo do cutlivo, morfologia e viabilidade do tecido estromal. Resultados: na estratégia 1, não foi encontrado diferença estatística na taxa de folículos secundários normais entre os grupos tecido fresco e vitrificado (27%, 14%, respectivamente; p>0,05). O tecido vitrificado apresentou morfologia frouxa (p<0,001). Houve marcação pelo BrdU em células da granulosa em folículos ativados nos grupos frescos e vitrificados. Os folículos do grupo ALFA-MEM apresentaram
    melhor crescimento in vitro ao longo dos 15 dias de cultivo em comparação com TCM fresco (p=0,03). Enquanto, no grupo vitrificado não foi encontrado diferença estatística entre os grupos (p=0,29). Foi encontrado diferença estatística na taxa de sobrevida entre todos os grupos (p=0,04). Não houve diferença entre os grupos TCM e ALFA-MEM vitrificado na taxa de recuperação total de oócitos/COCs, recuperação de oócitos com morfologia normal (p=0,37), COCs (p>0,05), COC submetidos à MIV e houve diminuição do diâmetro oocitário pós MIV em todos os grupos, sendo que somente oócitos em vesícula germinativa foram obtidos. Na estratégia 2 foi encontrado menor taxa de folículos primordiais nos grupos cultivados fresco e vitrificado (p<0,01). No grupo vitrificado cultivado o tecido apresentou morfologia frouxa nas regiões da túnica e córtex. O crescimento entre os grupos fresco e vitrificado não houve diferença estatística (p=0,38). Não foi encontrado diferença entre os grupos fresco e vitrificados na taxa de sobrevida (56%;45%,respectivamente; p=1,0), formação da cavidade antral (0,9%; p=0,4), recuperação total de oócitos/COC (27%;64%; p=0,06), recuperação de oócitos e COCs normais (67%, 25%; p=0,27). Na estratégia 3, o meio ALFA-MEM apresentou melhor crescimento ao longo cultivo por 15 dias (p<0,01) em ambos os grupo. No final do cultivo foi encontrado diferença estatística na taxa de sobrevida entre todos os grupos (p=0,002). A taxa de formação da cavidade antral não foi encontrado diferença estatística entre folículos criopreservados nos dois grupos (p=0,99). Não foi encontrado diferença estatística na recuperação total de oócitos/COC, na recuperação de oócitos normais, COCs normais entre todos os grupos (p>0,05). Nos grupos vitrificados não houve diferença entre os COCs recuperados (p=0,1). No grupo ALFA-MEM vitrificado 33% apresentaram
    oócitos em estadio rompimento da vesícula germinativa. Conclusões: concluimos que em todas estas técnicas ocorreu dano à unidade folicular comprometendo o desenvolvimento ideal dos folículos secundários in vitro, onde o congelamento dos folículos secundários isolados ou in situ não proporcionou resultados superiores de um em relação ao outro. Porém, o cultivo prévio dos folículos ainda inclusos no tecido criopreservado (estratégia 2) influenciou negativamente a capacidade de desenvolvimento folicular quando comparados ao isolamento de folículos secundários para cultivo a partir de tecido criopreservado (estratégia 1) ou cultivo de folículos secundários criopreservados isoladamente (estratégia 3). Quando avaliado o desenvolvimento in vitro dos folículos secundários criopreservados, não obtivemos superioridade do meio ALFA-MEM em relação ao TCM, sendo que apenas no grupo fresco o meio ALFA-MEM mostrou melhores resultados. Porém, mais estudos são necessários para o aprimoramento do protocolo de maturação in vitro folicular
  • Data de criação/publicação: 2016
  • Formato: 173 p anexos.
  • Idioma: Português
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