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Caracterização físico-química e estrutural do SbKI, um inibidor de serinoproteases de sementes de barbatimão (Stryphnodendron barbatiman)

Nakahira, Marcel

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos 2004-12-17

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Caracterização físico-química e estrutural do SbKI, um inibidor de serinoproteases de sementes de barbatimão (Stryphnodendron barbatiman)
  • Autor: Nakahira, Marcel
  • Orientador: Beltramini, Leila Maria
  • Assuntos: Inibidor De Protease; Inibidor De Serinoproteases; Inibidores Proteícos; Protease Inhibitor; Protein Inhibitors; Serinprotease Inhibitors
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: Os inibidores de proteases desempenham nas plantas funções como: defesa contra ataque de predadores de sementes, regulação de enzimas endógenas e fontes de proteínas e aminoácidos. Muitos destes inibidores são utilizados em estudos bioquímicos, bem como no tratamento de patologias humanas como inflamação e câncer. Neste trabalho, um inibidor de serinoprotease, presente na semente de Stryphnodendron barbatinan (barbatimão), foi purificado, caracterizado e denominado SbKI. Sementes de barbatimão maduras foram trituradas, até a obtenção de uma farinha, e esta foi suspensa em PBS, pH 7,4 (1 :5 m/v), sob agitação por 14 horas a 4°C. O extrato foi centrifugado, filtrado e tratado com PVPP, sendo denominado EB, o qual apresentou inibição da coagulação sanguínea e da atividade de algumas serinoproteases. O inibidor SbKI foi purificado utilizando-se três procedimentos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular (Superdex-75, 10/30), troca iônica (Mono-S HR, 5/5), ambas acopladas em um sistema &TA Purifier e fase reversa (C-18, Waters 250 x 4,6mm) acoplada a um sistema HPLC. Em cada etapa de purificação a presença do inibidor foi monitorada pelos testes de atividade inibitória da tripsina e da coagulação, ambos in vitro. SDS-PAGE, sob condições redutoras, mostrou que o inibidor é formado por duas cadeias polipeptídicas (cadeia pesada e leve) unida por ligação dissulfeto. As cadeias foram separadas pela cromatografia de &se reversa após serem reduzidas e alquiladas. Suas seqüências N-terminais foram determinadas pela degradação de Edman, em seqüenciador automatizado, apresentando alta identidade seqüencial com inibidores do tipo Kunitz de outras leguminosas. A determinação da massa/molecular do inibidor e de suas cadeias isoladas, foram determinadas por espectroscopia de massa (LCtESI-MS system) mostrando massas moleculares de 19.570Da7 15530Da e 4040Da, respectivamente. A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou que o inibidor é formado predominantemente por elementos beta e estruturas desordenadas. SbKI foi estável a variações de pHs (2-12) e temperaturas extremas e a temperatura de transição foi calculada em 73,3\" C. A determinação das constantes de inibição (KI) foi realizada para as serinoproteases tripsina (KI = 5,5 nM) e calicreína plasmática (KI = 1,l nM).
  • DOI: 10.11606/D.76.2004.tde-01042014-174549
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Física de São Carlos
  • Data de criação/publicação: 2004-12-17
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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