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Caracterização bioquímica de β-glicosidases variantes de Humicola insolens evidências de transglicosilação no fenômeno de estimulação da enzima pelo produto de reação

José Carlos dos Santos Salgado João Atílio Jorge

2016

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Salgado, José Carlos dos S. )(Acessar)

  • Título:
    Caracterização bioquímica de β-glicosidases variantes de Humicola insolens evidências de transglicosilação no fenômeno de estimulação da enzima pelo produto de reação
  • Autor: José Carlos dos Santos Salgado
  • João Atílio Jorge
  • Assuntos: PROTEÍNAS; GLICOSE; ENZIMAS; BIOQUÍMICA; HIDRÓLISE
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: As β-glicosidases (BGL) são enzimas que catalisam, em condições fisiológicas, a hidrólise de alquil- e aril-β-glicosídeos, di-glicosídeos e oligossacarídeos curtos. BGLs removem um resíduo de β-D-glicosil da porção não-redutora de glicoconjugados, incluindo glicosídeos, ésteres 1-O-glicosil e oligossacarídeos. As funções desempenhadas pelas β-glicosidases nos organismos são diversas, podendo ser destacadas a hidrólise de celooligosacarideos curtos e celobiose em bactérias e fungos. A hidrólise de material lignocelulósico (MLC) por enzimas tem sido bastante estudada desde a década de 50, sendo as BGL enzimas chaves no processo por diminuírem a inibição pelo produto de reação das endocelulases e celobiohidrolases. Algumas BGL pertencentes a família 1 de gicosil hidrolase 1 (GH1) são tolerantes e até estimuladas pelo produto de reação (glicose), sendo que nos últimos anos, tem sido estudado quais os mecanismos que estariam envolvidos no fenômeno de estimulação dessas enzimas pelo produto de reação. O presente trabalho se propôs a tentar elucidar resíduos de aminoácidos-chave que seriam cruciais para a estimulação de uma BGL GH1 de Humicola insolens (Bglhi), a qual foi expressa em sistema heterólogo e possui a sua estrutura tridimensional resolvida. Foi construída uma biblioteca de diversidade gênica utilizando a técnica de epPCR, visando inserir mutações aleatórias no gene e consequentemente produzir substituições na sequência de aminoácidos. Foram gerados 4435 clones transformados com o plasmídeo pET28_bglhi, dos quais 418 exibiam atividade catalítica em placa utilizando o substrato esculina. Em uma segunda etapa, outra pressão seletiva foi exercida visando selecionar enzimas que exibiam fator de estimulação maior que dois (FE ˃ 2) na presença de 100 mmol.L-1. Nesta etapa 8 clones se mostraram promissores e após testes posteriores os clones 3-5A e 4-8A foram selecionados para prosseguimento do
    trabalho. A variante 3-5A possui quatro substituições na sequência de aminoácidos e a 4-8A possuí duas substituições. As substituições da enzima variante 4-8A foram identificadas e duas novas variantes N89Y (asparagina por tirosina) e H307Y (histidina por tirosina), com uma mutação cada, foram criadas através de mutagênese sítio dirigida. Ambas variantes apresentaram as propriedades bioquímicas (pH, e resposta a temperatura) bem similares a Bglhi e da variante 4-8A. Entretanto, H307Y exibiu a alta taxa de estimulação de glicose e xilose exibida pela variante 4-8A. Todas as enzimas variantes tiveram uma diminuição na afinidade aparente pelo substrato na presença de concentrações estimulatórias de glicose ou xilose. Analisando os produtos de reação de Bglhi, 4-8A e H307Y, observamos que as enzimas variantes superestimuladas possuíam um aumento na reação de transglicosilação utilizando tanto o substrato sintético (pNP-Glc) como o substrato natural (celobiose), mesmo após tempos curtos de reação. Na presença de concentrações estimulatórias de glicose ou xilose, há um desvio em favor das reações de transglicosilação em detrimentos da via de hidrólise. Sendo que a relação transglicosilação/hidrólise é 4:1. Os resultados mostram que durante o curso da reação os transglicosilados são também clivados, o que interferem nas determinações das constantes de afinidades. Quando a xilose é utilizada na presença de celobiose, há a formação de um dissacarídeo incomum conhecido como glicopiranosil-xilose (GX), sendo até o momento o primeiro trabalho que relata a produção desse dissacarídeo por via de reação de transglicosilação. Nossos dados sugerem que a substituição de histidina por tirosina na variante 307 favorece a ligação do sítio ativo da enzima com um aceptor glicosídico em detrimento a ligação com a água. Esse favorecimento faz com que a reação de transglicosilação seja maior do que a
    reação de hidrólise. Desse modo, os dados obtidos nesta tese permitem afirmar que o resíduo de aminoácido da posição 307 seria chave no fenômeno de estimulação de Bglhi por glicose e xilose, estando intimamente relacionado com as reações de transglicosilação. Apesar da variante 307 exibir reação de transglicosilação durante a hidrólise de celobiose, por exemplo, a hidrólise do substrato é estimulada, pois há necessidade de glicose para a formação dos transglicosilados. Este fato reflete no aumento dramático da velocidade instantânea, mesmo quando se observa somente a glicose como produto final. O aumento global da velocidade de hidrólise do substrato e a hidrólise total dos transglicosilados durante o progresso da reação, justifica a utilização das variantes estimuladas pelos produtos em processos industriais
  • Data de criação/publicação: 2016
  • Formato: 171 p.
  • Idioma: Português
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