Modulação da degradação enzimática de galactomanano por sua própria estrutura fina

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Título:
Modulação da degradação enzimática de galactomanano por sua própria estrutura fina
Autor: Encarnação, Thalita Beatriz Carrara Da
Orientador: Buckeridge, Marcos Silveira
Assuntos: Α -Galactosidase; Sesbania Virgata (Cav.) Pers; Estrutura Fina De Polissacarídeos; Purificação Enzimática; Galactomanano; Parede Celular; Mobilização De Reserva; Α Galactomannan; Fine Structure; Enzimatic Purification; Cellwall; Storage Mobilisation
Notas: Dissertação (Mestrado)
Descrição: Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas β-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose α-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (α-galactosidase, endo-β-mananase e exo-β-manosidase). A α-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações α-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados β-1,4), permitindo a ação da endo-β-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a β-manosidase atuará (ligações β-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da α-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-β-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) somente ou em conjunto com a α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A α-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 μmolGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da α-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da α-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da α-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da α-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-β-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da α-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da α-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da α-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da α-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-β-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-β-mananase e α-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula
DOI: 10.11606/D.41.2012.tde-01052013-121728
Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Biociências
Data de criação/publicação: 2012-11-26
Formato: Adobe PDF
Idioma: Português

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Encarnação, Thalita Beatriz Carrara Da

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Biociências 2012-11-26

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