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Geração de mutantes de Leishmania ssp superexpressores constitutivos de gene repórter ferrapentas úteis para a varredura de novas drogas

Mônicas Cristina Terrão Angela Kaysel Cruz

2008

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Terro, Mnica Cristina )(Acessar)

  • Título:
    Geração de mutantes de Leishmania ssp superexpressores constitutivos de gene repórter ferrapentas úteis para a varredura de novas drogas
  • Autor: Mônicas Cristina Terrão
  • Angela Kaysel Cruz
  • Assuntos: LEISHMANIA; EXPRESSÃO GÊNICA; GENES DE RESPOSTA IMUNE
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: O parasito Leishmania é o agente etiológico das leishmanioses, doença endêmica que representa sério risco para um décimo da população mundial. Não existindo vacina, o tratamento é realizado por administração de compostos que apresentam alto nível de toxicidade. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a criação de uma linhagem de Leishmania que possa ser utilizada na busca de novos compostos com ação leishmanicida. Genes de resistência a drogas utilizados na seleção de transfectantes podem interferir nas análises de diferentes compostos em teste, por isso, construímos cassetes portando genes repórteres sem marcador de seleção que foram transfectados em Leishmania, para serem incorporados no lócus do RNA ribossômico, sob controle do único promotor forte de Leishmania, que dirige a transcrição constitutiva de genes. Inicialmente modificamos vetores disponíveis portando o gene da proteína fluorescente verde (GFp) e dele extraímos o marcador de seleção. Testamos diferentes técnicas para seleção dos transfectantes com base na fluorescência: (i) separação das células fluorescentes em FACs; (ii) diluição limitante associada à análise em fluorímetros ou microscópio de fluorescência; (iii) co-transfecção com um plasmídeo circular portando o marcador de seleção e um fragmento linear portando o gene da GFP para inserção no lócus ribossômico. Entretanto, a baixa eficiência de transfecção não permitiu a recuperação de transfectantes em nenhuma das estratégias. Por isso,
    decidimos gerar construções que permitissem transfecção em etapas consecutivas (com marcadores de seleção positivo e negativo) para recuperar transfectantes que carregasse somente o gene repórter. A primeira transfecção foi feita com a utilização de um cassete que continha o gene da higromicina fosfotransferase (HYG), o gene da timidina kinase de HSV-1, e o gene repórter flanqueados pelas regiões de homologia com o lócus ribossômico. A seleção dos transfectantes positivos foi realizada na presença de higromicina B. Um segundo cassete contendo somente o gene repórter flanqueado pelas regiões de homologia com o genoma foi transfectado nos mutantes portando o primeiro cassete. A seleção foi feita pela utilização de ganciclovir, e a expressão da SEAP foi confirmada por luminometria. Os vários plasmídeos construídos nesse trabalho poderão ser instrumentos úteis para diversas aplicações. Mais importante, os mutantes de Leishmania resultantes da primeira transfecção são uma ferramenta poderosa para a inserção de qualquer gene de interesse, sem a interferência de genes de resistência
  • Data de criação/publicação: 2008
  • Formato: 80 p. anexos.
  • Idioma: Português
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