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Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S.

Nammoura Neto, Georges Mikhael

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas 2018-02-19

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Desenvolvimento e validação de método para a identificação de micro-organismos metabolicamente ativos em biofilmes de amostras ambientais através da análise de rRNA 16S.
  • Autor: Nammoura Neto, Georges Mikhael
  • Orientador: Schneider, Rene Peter
  • Assuntos: Amostras Ambientais; Miseq; Rt-Pcr; Extração De Rna; Bácterias Metabolicamente Ativas; Ardra; Environmental Samples; Rna Extract; Metabolically Active Bacteria
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente.
  • DOI: 10.11606/T.42.2018.tde-26032018-164037
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas
  • Data de criação/publicação: 2018-02-19
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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