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Seleção de anticorpo humano anti-FGF2 a partir do hibridoma secretor do anticorpo monoclonal 3F12E7

Magalhães, Carolina Georg

Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas 2021-12-01

Acesso online. A biblioteca também possui exemplares impressos.

  • Título:
    Seleção de anticorpo humano anti-FGF2 a partir do hibridoma secretor do anticorpo monoclonal 3F12E7
  • Autor: Magalhães, Carolina Georg
  • Orientador: Moro, Ana Maria; Tsuruta, Lilian Rumi
  • Assuntos: Fragmento De Ligação Ao Antígeno; Seleção Guiada; Humanização De Anticorpos; Melanoma; Phage Display; Antibody Humanization; Fragment Antigen Binding; Guided Selection
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Notas Locais: ICB - T.5884 – Observação - Tombo versão digital
  • Descrição: O fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) é considerado uma proteína chave no desenvolvimento do melanoma, sendo responsável por desempenhar papel importante no crescimento do tumor, angiogênese e metástase. O anti-FGF2 3F12E7,um anticorpo monoclonal (mAb) murino, foi previamente obtido por colaboradores e mostrou ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, quando testado em camundongos. Considerando o potencial terapêutico do mAb anti-FGF2 3F12E7, somado à limitação do uso deste anticorpo murino em humanos, neste trabalho tivemos como objetivo a humanização deste anticorpo utilizando a tecnologia de phage display para a obtenção, pela técnica de seleção guiada, de anticorpos humanos correspondentes ao mAb murino anti-FGF2 3F12E7. Para o processo de humanização foram construídas três bibliotecas de fragmento de ligação ao antígeno (Fab): murino, híbrido e humano. As técnicas de phage display, panning, phage ELISA e ELISA foram realizadas, em cada etapa da humanização, para a seleção de Fab com afinidade pelo antígeno recombinante FGF2 (rFGF2). A construção da biblioteca Fab murino foi realizada a partir do hibridoma anti-FGF2 3F12E7. O gene Fd (região variável e primeiro domínio constante da cadeia pesada VH+CH1) do clone murino com maior ligação ao rFGF2 por ELISA foi clonado em vetor contendo a biblioteca de genes de cadeia leve (LC) humanos para a construção da biblioteca Fab híbrido. Os genes LC humanos de três clones híbridos selecionados por ELISA foram clonados em vetor contendo a biblioteca de genes Fd humanos para a construção das bibliotecas Fab humano. Os clones Fab humanos selecionados com afinidade pelo rFGF2 apresentaram stop códon na sequência da LC, apesar de possuírem sequências Fd funcionais. A estratégia de seleção guiada utilizada não possibilitou a seleção de clones Fab humanos funcionais, porém resultou na seleção de LC e Fd humanas funcionais. Seguiu-se para a estratégia de clonar as regiões variáveis das LC e Fd humanas em vetores AbVec (contendo os genes da região constante da LC e HC de imunoglobulina humana) e combinar cada uma das 3 LC com as 8 HC humanas selecionadas para expressão de IgG completos por cotransfecção transitória em células HEK293-F. Dos 20 anticorpos expressos, 7 mostraram ligação ao rFGF2 por ressonância plasmônica de superfície (SPR). A atividade funcional desses 7 anticorpos foi avaliada através de ensaios in vitro de proliferação e migração celular utilizando células endoteliais humanas (HUVEC) e células de melanoma humano (SKMel-28). Os anticorpos humanos anti-FGF2 62K98H e 85L117H foram capazes de reduzir, de forma significante, o número de células viáveis e de atenuar a migração celular, nas duas linhagens celulares, em comparação ao controle negativo (IgG irrelevante), resultado próximo ao observado anteriormente com o anticorpo murino anti-FGF2 3F12E7 utilizado como modelo para a humanização.
  • DOI: 10.11606/T.42.2021.tde-04052022-162508
  • Editor: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Ciências Biomédicas
  • Data de criação/publicação: 2021-12-01
  • Formato: Adobe PDF
  • Idioma: Português
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