Estudos para manipulaão genética em Leishmania brazWiliensis

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Título:
Estudos para manipulaão genética em Leishmania brazWiliensis
Autor: Eliane Cristina Laurentino
Ângela Kaysel Cruz
Assuntos: BIOQUÍMICA
Notas: Dissertação (Mestrado)
Descrição: Nosso objetivo foi iniciar estudos genéticos em Leishmania braziliensis, um protozoário da ordem Kinotoplastida, pertencente à família tripanosomatidae, encontrada comumente no Novo Mundo, especificamente na América Latina. Essa espécie é degrande importância médica sendo muito pouco estudada em virtude das dificuldades no estabelecimento de condições experimentais para cultura e manipulação genética. O alvo de nossos estudos foi a região que contém o gene para a dihidrofolatoredutase timidilato sintase (DHFRTS), similar à região R em L. major (BEVERLEY e cols., 1984; CODERRE e cols., 1983). O nosso intuito era estabelecer condições para poder gerar mutantes nulos para esse gene essencial, por recombinação homóloga(CRUZ & BEVERLEY, 1990; CRUZ e cols., 1991). Mutantes auxotróficos para timidina, a exemplo daqueles gerados para L. major, poderão ser testados como vacina contra leishmaniose (TITUS e cols., 1995). Para tornar isso possível, estabelecemoscondições para cultura axênica e transfecção para L. braziliensis. Nosso objetivo foi iniciar estudos genéticos em Leishmania braziliensis, um protozoário da ordem Kinotoplastida, pertencente à família tripanosomatidae, encontrada comumente noNovo Mundo, especificamente na América Latina. Essa espécie é de grande importância médica sendo muito pouco estudada em virtude das dificuldades no estabelecimento de condições experimentais para cultura e manipulação genética. O alvo de nossosestudos foi a
região que contém o gene para a dihidrofolato redutase timidilato sintase (DHFRTS), similar à região R em L. major (BEVERLEY e cols., 1984; CODERRE e cols., 1983). O nosso intuito era estabelecer condições para poder gerar mutantesnulos para esse gene essencial, por recombinação homóloga (CRUZ & BEVERLEY, 1990; CRUZ e cols., 1991). Mutantes auxotróficos para timidina, a exemplo daqueles gerados para L. major, poderão ser testados como vacina contra leishmaniose ) (TITUS e cols., 1995). Além disso, analisamos a estrutura do locus do gene DHFRTS comparando-a com mesmo locus de outra espécie, a L. major e avaliamos a possibilidade de obter amplificação gênica do mesmo em resposta ao tratamentocom a droga metotrexato (MTX). Um dos mecanismos de aquisição de resistência a drogas de Leishmania ocorre através da amplificação de regiões específicas do genoma. Sabe-se que células de L. braziliensis normalmente não se desenvolvem bem emcultura líquida. Com base em estudos anteriores, a urina humana parece conter componentes que propiciam melhor desenvolvimento desta espécie em meio axênico (HOWARD e cols., 1991; ARMSTRONG e cols., 1994). Adicionamos urina humana a 2% ao meiode cultura. Como a idéia é possibilitar um nocaute por recombinação homóloga, a inserção de DNA exógeno, deve ser viável e, por esse motivo, otimizamos as condições de transfecção para essa espécie. Para o início do processo de substituição dogene da DHFRTS em L. braziliensis era fundamental
ter conhecimento sobre o nível de conservação de sua região entre as espécies L. major e L. braziliensis. Algumas estratégias foram conduzidas paralelamente para a geração de um vetor a serutilizado no nocaute: (i) indução de amplificação gênica desta região, por tratamento com MTX, (ii) uso do próprio vetor utilizado para L. major, ou (iii) construção de um vetor específico para L. braziliensis, caso o grau de similaridade entreas regiões flanqueadoras do gene não permitisse a recombinação homóloga. Algumas leishmanias apresentam resistência a drogas, devido a amplificação de determinadas porções do genoma. Da amplificação da região R (por pressão da droga Metotrexato- MTX) surge um amplicon, com capacidade de auto replicação, e a partir dele, novos vetores foram construídos e abriram muitos caminhos nos estudos dos mecanismos moleculares deste parasita. AL. braziliensis foi submetida ao tratamento ) com MTX, em dois experimentos independentes, porém não adquiriu resistência à droga. Experimentos de híbridação denotaram uma baixa conservação das seqüências flanqueadoras de DHFRTS de L. major e L. braziliensis, o que invalidou ouso do vetor com seqüência de L. major. Assim, foi construída uma biblioteca genômica de L. braziliensis por digestão parcial com a enzima Sau 3A1. Após ordenar a biblioteca, clone a clone, e transferi-la para membranas de náilon, verificou-se,por hidratação, que ela não tinha clones positivos para DHHFRTS. Uma estratégia
adotada foi a utilização de iniciadores ("primers"), desenhados partir da seqüência do gene de DHFRTS de L. major (Beverley e cols., 1986) para amplificar somente aregião codificadora (que deveria apresentar um maior grau de conservação entre espécies), interrompê-lo com uma marca de resistência à droga (higromicina B) e cloná-lo em vetor apropriado. A reação de polimerização em cadeia ocorreu, e essa novaestratégia para a produção de vetor para nocaute, foi desenvolvida. Clonamos o gene da DHFRTS de L. brsziliensis (um fragmento de 1,6 kb, aproximadamente) obtido por PCR. Este clone foi utilizado para a obtenção da seqüência de nucleotídeoscompleta da fase de leitura aberta ("open reading frame" - ORF) de L. braziliensis o que nos permitiu detectar polimorfismo interno ao gene, que poderá representar um instrumento diagnóstico interessante
Data de criação/publicação: 2000
Formato: 77 p.
Idioma: Português

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Eliane Cristina Laurentino Ângela Kaysel Cruz

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