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Caracterização funcional de sequências envolvidas no processo de segregação mitótica dos cromossomos de Leishmania major

Liane Casagrande Ângela Kaysel Cruz

2000

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Casagrande, Liane )(Acessar)

  • Título:
    Caracterização funcional de sequências envolvidas no processo de segregação mitótica dos cromossomos de Leishmania major
  • Autor: Liane Casagrande
  • Ângela Kaysel Cruz
  • Assuntos: BIOQUÍMICA
  • Notas: Tese (Doutorado)
  • Descrição: O centrômero é uma região especializada encontrada em todos os cromossomos eucarióticos, sendo o sítio de formação do cinetocoro e ligação do fuso nuclear, além de regular a segregação dos cromossomos durante a mitose e a meiose, no processo de divisão celular, A avaliação dos dados disponíveis, desde leveduras até humanos, sugere que apesar dos centrômeros serem elementos de DNA altamente variáveis, um padrão conservado de organização e função dessas sequências está começando a surgir. Para a identificação de potenciais sequências centroméricas em Leishmania utilizamos uma biblioteca genômica e duas sub-bibliotecas cromossômicas. Essas bilbliotecas foram construídas utilizando-se vetores especiais que contém repetições teloméricas dispostas de forma a permitir que sejam transfetados e que se mantenham na célula, possibilitando a busca de sequências estabilizadoras com uma estratégia de complementação funcional. Uma vez adquirida tal sequência o recombinante se comportará como um cromossomo artificial (LAC - Leishmanla Artificial Chromosome) dentro da célula do parasita. As três bibliotecas foram transfectadas em L. major e somente aqueles transfectantes carregando sequências responsáveis pela segregação acurada do material genético desse protozoário, deveriam apresentar-se como elementos estáveis, na ausência da pressão pela droga de seleção. O estudo da dinâmica de manutenção dos LACs dos transfectantes, foi feita pela combinação de duas estratégias,
    estabelecidas no desenvolvimento do projeto: um ensaio modificado de diluição limitante, seguido por uma avaliação do crescimento celular em leitor ELISA, por intermédio do qual várias células individualizadas de um mesmo clone eram classificadas quanto à manutenção dos LACs. Esta estratégia facilitou a análise de um grande número de transfectantes e esclareceu a dinâmica de manutenção dos cromossomos exógenos. Essa cinética de "Porcentagem de Manutenção do ) LAC", permitiu a caracterização de recombinantes que carregam elementos estabilizadores, potencialmente importantes para a segregação dos cromossomos durante mitoses sucessivas. Para as duas sub-bibliotecas testadas, mais de 78% dos LACs apresentaram-se instáveis, enquanto os transfectantes restantes apresentaram graus variados de estabilidade sendo o maior deles de 46%. Os clones apresentados uma alta porcentagem de manutenção do LAC foram identificados e o mapa de restrição de dois desses clones foi construído. Esses dois clones apresentam sequências em comum, apesar de não representarem sequências contíguas no genoma do parasita. As dificuldades de construção do mapa de restrição desses clones sugere a presença de sequências repetitivas. Deleções aleatórias, seguidas de testes funcionais indicam que clones de tamanho inferiores aos 40 Kb originais não se mantêm estáveis. O sequenciamento dos dois clones deverá revelar elementos comuns que potencialmente desempenhem a função de
    sequências centroméricas
  • Data de criação/publicação: 2000
  • Formato: 102 p.
  • Idioma: Português
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