Regulação da expressão gênica em linfócitos por RNAs reguladores papel da proteína quinase dependente de RNA (PKR) e do fator de transcrição NF-'capa'B

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Regulação da expressão gênica em linfócitos por RNAs reguladores papel da proteína quinase dependente de RNA (PKR) e do fator de transcrição NF-'capa'B
Autor: Liliana Rodrigues de Souza
Fernando Luiz De Lucca
Assuntos: FATORES IMUNOLÓGICOS; REGULAÇÃO GÊNICA; BIOQUÍMICA
Notas: Tese (Doutorado)
Descrição: A proteína quinase dependente de RNA (PKR), uma quinase serina-treonina específica, é um dos mediadores importantes da atividade antiviral dos interferons (IFNs) 'alfa' e ß. Os estudos sobre a PKR permaneceram, durante muitos anos, restritos ao âmbito do mecanismo de ação dos IFNs 'alfa' ß , acreditando-se que somente o RNA de origem viral era capaz de ativar esta proteína quinase. Os dados recentes da literatura mostram que a PKR está também envolvida na regulação da transcrição e tradução, bem como na transdução de sinal, apoptose e controle do ciclo celular. O fato de participar da regulação de importantes funções celulares sugere que a atividade da PKR possa ser também modulada por RNAs celulares. Recentemente, foi demonstrado que o RNA obtido de células 3T3, não infectadas por vírus, é capaz de ativar a PKR. Verificou-se ainda que esta proteína quinase ativa o fator de transcrição NF-'capa'B através da fosforilação do seu inibidor I-'capa'B'alfa'. É fato conhecido que os promotores de vários genes, entre os quais os genes do IFN-'gama', TNF e outras citocinas, possuem sítios ('capa'B) de ligação para o NF-'capa'B. Estudos anteriores deste Laboratório mostraram que o tratamento de linfócitos humanos com o RNAp9, obtido de órgãos linfóides de animais imunizados com o peptídeo sintético p9 (pol:476-484) do HIV-1, é capaz de induzir linfócitos T citotóxicos e a secreção de IFN-'gama'. O objetivo principal deste trabalho foi contribuir para a
elucidação dos eventos moleculares envolvidos na modulação de linfócitos humanos através de RNAs reguladores induzidos pela imunização com o peptídeo p9, e nossa proposição inicial foi investigar a participação da PKR e do fator de transcrição NF-'capa'B neste fenômeno. Assim, investigamos se a indução de citotoxicidade e da secreção de IFN-'gama', observada nos linfócitos tratados com RNAp9, era mediada pela PKR e pelo NF-'capa'B. O efeito do RNAp9 sobre a atividade ... da PKR foi avaliado através de ensaios desta proteína quinase em extratos de linfócitos humanos na presença de ATP ['gama'-p³²] e, no caso de células intactas, adicionando-se ortofosfato-[p³²] ao meio de cultura dos linfócitos. Após os ensaios de fosforilação, a PKR foi purificada, separada por eletroforese em gel de poliacrilamida e detectada por autoradiografia. Desde que o RNAp9 representa o RNA celular total, realizamos também o seu fracionamento em coluna de afinidade com objetivo de identificar a fração de RNA responsável pelo efeito biológico. Os resultados obtidos com os ensaios celulares mostraram que o RNAp9 poli A( +) é capaz de ativar a PKR de linfócitos humanos e de induzir a degradação dos inibidores I-'capa'B'alfa'. e I- 'capa'Bß do NF-'capa'B. Observamos que a fração RNAp9 poli A(-) não apresentou efeito, bem como o RNA extraído de animais não imunizados (RNA-N). Verificamos ainda que a fosforilação dos I-'capa'Bs resultante da
ativação da PKR pelo RNAp9 constitui um sinal para a degradação destes inibidores do fator de transcrição NF-'capa'B através da via ubiquitina-proteassoma. A ativação do fator de transcrição NF -'capa'B, foi também detectada através do ensaio EMSA (eletrophoretic mobility shift assay). Demonstramos que após o tratamento das células com RNAp9 e RNAp9 poli A(+), ocorreu um aumento da quantidade de NF-'capa'B no núcleo, indicativo da ativação deste fator de transcrição. Verificamos também que o MG-132 é capaz de bloquear a ativação do NF -'capa'B induzida por RNAp9 poli A(+), pois impede a translocação nuclear deste fator de transcrição. Este resultado constitui uma forte evidência de que a via ubiquitina- proteassoma está envolvida na degradação dos I-'capa'Bs observada nos linfócitos humanos tratados com RNAp9 poli A(+). Em resumo, os resultados de nosso trabalho demonstraram que o RNAp9 é capaz de modular a atividade da PKR de linfócitos humanos, tanto ... em extratos celulares como em células intactas, induzindo a degradação do I-'capa'B'alfa'. e do I-'capa'Bß com conseqüente ativação do NF-'capa'B. A ativação deste fator de transcrição, permitiria a sua migração-o para o núcleo onde se ligaria aos promotores que apresentam sítios 'capa'B, facilitando a expressão de genes específicos, entre os quais os genes de várias citocinas. Os nossos dados sugerem, portanto, que o RNAp9 poli A(+) pode regular expressão gênica em
linfócitos humanos em nível transcricional. A elucidação do mecanismo molecular envolvido nos efeitos do RNAp9 poli A(+) podem contribuir para o estabelecimento de uma base racional para uso deste RNA regulador como imunomodulador em pacientes infectados com HIV-1
Data de criação/publicação: 2004
Formato: 161 p. anexos.
Idioma: Português

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Regulação da expressão gênica em linfócitos por RNAs reguladores papel da proteína quinase dependente de RNA (PKR) e do fator de transcrição NF-'capa'B

Liliana Rodrigues de Souza Fernando Luiz De Lucca

2004

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