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Identificação de um novo gene pró-proliferativo associado com a progressão do melanoma e a mutação ativadora de Braf

Cristiano Gonçalves Pereira Enilza Maria Espreafico

2010

Localização: FMRP - Fac. Medicina de Ribeirão Preto    (Pereira, Cristiano Gonçalves )(Acessar)

  • Título:
    Identificação de um novo gene pró-proliferativo associado com a progressão do melanoma e a mutação ativadora de Braf
  • Autor: Cristiano Gonçalves Pereira
  • Enilza Maria Espreafico
  • Assuntos: NEOPLASIAS; MELANOMA; BIOMARCADORES; ONCOGENES
  • Notas: Dissertação (Mestrado)
  • Descrição: A identificação e caracterização de novos genes com expressão tumor-específica é uma ferramenta potencialmente útil para o desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico e terapia do câncer. Utilizando ferramentas de bioinformática desenvolvidas localmente para mineração de bancos de dados de ESTs, nosso grupo identificou 29 clusters UniGene de múltiplas ESTs provenientes exclusivamente de fontes de melanoma, e validou experimentalmente a expressão especifica em melanoma para três destes genes, sem potencial codificador segundo programas de predição. No presente trabalho, buscou-se estender a análise de validação para um grupo de genes da mesma lista com potencial codificador e também sem qualquer caracterização funcional prévia. Dos genes inicialmente propostas para análise neste trabalho, BC019009 (HTA), Similar to hypothetical protein (L1 H3), sinovial sarcoma (SSX-5)Carbonic anhydrase XIV (CA14), ‘beta’-Tubulina 4Q (TUBB4Q), Zinc finger protein 705D e 705A (ZNF705D, ZNF705A), não foi possível detectar a presença de mRNA para os quatro últimos em amostras de cDNA de um grupo de linhagens de melanoma, por qRT-PCR. Demonstramos que HTA (Hs.382776) e L1 H3 (Hs.617329) apresentam expressão bastante enriquecida em células de melanoma, ainda que detectada também em outros poucos tecidos. L1H3 mostrou expressão variável entre amostras de nevos, melanoma primário e mestastático, sem diferenças significativas entre os grupos. HTA apresentou baixa expressão em melanócitos normais e nevos, e ganho de expressão em 45% das amostras de tumor primário e 70% das metástases, mostrando correlação positiva com a progressão do melanoma e com a ocorrência da mutação oncogênica de BRAF V600E. Sendo assim, elegemos este gene para posteriores análises funcionais. O gene HTA encontra-se na região cromossômica 16q22.3, contém três exons e ORFs de 92a iniciada com códon
    AUG e uma ORF de 139aa iniciada com UUG. A ORF considerada mais provável segundo análises do potencial codificador e relatório do GenBank é a de 279 pb, da qual se deduz uma sequência protéica de 92 resíduos de aminoácidos. O fragmento correspondente à ORF279 foi clonado para expressão em células de mamífero e bactéria. A proteína em fusão com EGFP (HTA-EGFP), expressa em células de melanoma, assim como em outros tipos celulares, localiza-se fortemente no núcleo e apresenta massa molecular aparente condizente com a massa calculada (12 kDa). A proteína em fusão com GST (GST-HTA) foi expressa em bactéria e purificada para produção de anticorpos e uso como antígeno na busca por anticorpos circulantes em paciente com melanoma em trabalhos futuros. O silenciamento do gene HTA por siRNA, em células de melanoma metastáticas (linhagem WM1617) que naturalmente superexpressam este gene, não afetou a capacidade de migração celular, mas causou redução significativa na taxa de proliferação sob condições normais de adesão e também no crescimento independente de ancoragem (formação de colônia em agar). Os dados obtidos sugerem fortemente que a ativação do gene HTA esteja associada com a mutação ativadora de BRAF e exerça um papel promotor da progressão do melanoma. Concluindo, o trabalho abre perspectivas para futuros investimentos em direção à ampla caracterização do gene HTA, buscando definir a real relevância do gene na progressão do melanoma e sua utilidade como marcador prognóstico ou alvo terapêutico
  • Data de criação/publicação: 2010
  • Formato: 118.
  • Idioma: Português
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